外源硫化氢对氧化应激下铜绿假单胞菌生长和生物膜的调节作用

董晶晶，蒋秀婷，偶德馨，邹艳艳，叶应旺

（合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽合肥 230000）

铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性细菌，常见于饮用水、土壤、医疗器械表面，甚至动物、植物和其他生物的组织中[1-3]。在过去的100年中，铜绿假单胞菌已进化为最重要的人类病原体之一[4]。铜绿假单胞菌在呼吸道感染性疾病中最为常见，是引起呼吸相关肺炎和医院感染的重要病原体[5]，在患有代谢疾病、血液病、恶性肿瘤和术后感染的患者中是高度敏感的病原体。在目前已知的病原菌中，铜绿假单胞菌的基因组最大，调节基因最多，耐药机制异常复杂[6]。

H2S是继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后发现的第三种气体信号分子[7]，能够调节许多生理和病理过程，并与生物系统中的各种疾病相关[8,9]。虽然H2S已经被人们认识了几个世纪，但它在细菌生理学中的作用仍是一个新的知识[10]。目前的研究表明H2S既有保护细菌免受氧化应激的作用，又有杀死细菌的功能[11]。Shatalin等人[12]于2011年提出H2S作为细菌对抗抗生素的一般防御机制：内源性H2S通过干扰 Fenton反应和刺激活性氧（ROS）清除酶来减少ROS的形成，从而促进抗生素耐药性。这种机制适用于金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和炭疽杆菌。然而，长期以来，H2S也被认为是有毒的，作为一种生长抑制分子，破坏DNA、破坏二硫键交联使蛋白质变性、与辅基结合使金属酶的氧化还原中心失活，并增强氧化应激[13]。最近，H2S已被证明对某些微生物具有细胞毒性作用[14-17]，Renieris等人[18]强调宿主衍生的H2S是对抗铜绿假单胞菌感染的一种新的保护机制：通过增强中性粒细胞的吞噬活性，以及抑制铜绿假单胞菌的细胞间通讯系统（QS系统），使其更容易被吞噬掉，从而保护宿主健康。付榴辉等人[19]表明H2S通过氧化损伤对大肠杆菌具有抗菌作用。

在本研究中，尝试了解外源性H2S对氧化应激条件下铜绿假单胞菌的影响。通过存活率、细菌形态和生物膜的相关实验，发现H2S会加剧H2O2对铜绿假单胞菌的杀伤作用。

1 材料与方法

1.1 菌株

1.1.1 实验材料

菌株：铜绿假单胞菌的野生型菌株（WT）购于广东省微生物培养中心。

主要试剂：Luria-Bertani（LB）肉汤培养基、平板计数培养基（PCA），北京奥博星生物技术有限责任公司；溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，青岛海博生物；0.9%氯化钠注射液（生理盐水），江苏科伦药业有限公司；磷钨酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；丙三醇（分析纯）、无水乙醇、结晶紫，国药集团化学试剂有限公司；伴刀豆球蛋白A（FITC-Con A）、PI染料，美国sigma-aldrich公司。

1.1.2 主要仪器设备

DW-86L416G -80 ℃低温保存箱，青岛海尔生物医疗股份有限公司；SHP-80生化培养箱，上海培因实验仪器有限公司；JMY-100C恒温摇床，上海久茂仪表有限公司；Infinite 200 Pro酶标仪，瑞士TECAN公司；JEM-1400flash LaB6透射电子显微镜，日本JEOL公司；热场发射扫描电子显微镜，德国卡尔蔡司；FV1000激光共聚焦扫描显微镜，日本OLYMPUS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌生长曲线的测定

吸取-80 ℃保存的野生型菌株PAO1于5 mL无菌LB肉汤培养基中过夜培养，在溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上三区划线进行分离纯化，然后将培养皿倒置于 37 ℃恒温培养箱中培养；从隔夜培养的溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上挑取单个菌落于5 mL无菌LB管中，在37 ℃、180 r/min下培养18 h以获得种子溶液；按1%的接种量将种子溶液接种至5 mL无菌LB和5 mL加入0.2 mmol/L NaHS的无菌LB中。然后，分别吸取200 µL培养物添加到96孔板中，每隔两小时测量并纪录600 nm处的光密度（OD）吸光值。

1.2.2 存活率

将菌株在LB和含有0.2 mmol/L NaHS的LB中培养，然后分别在0、1、2和2.5 mmol/L下进行H2O2压力处理，在37 ℃、200 r/min下摇晃0.5 h、1 h和1.5 h。到达相应时间点后，用无菌生理盐水梯度稀释细菌溶液，然后在平板计数琼脂培养基（PCA）温度大约50 ℃时通过倾注倒平板。培养皿倒置在37 ℃恒温培养箱中培养 16 h~18 h。使用菌落计数法进行计数。每组实验均进行三次。存活率（%）=（不同浓度H2O2下的菌落数/未经H2O2处理下的菌落数）×100%。

1.2.3 透射电子显微镜测细菌形态

将菌株分别培养在LB和含有0.2 mmol/L NaHS的LB中，然后在0、1、2和2.5 mmol/L下进行H2O2压力处理 1 h。使用透射电子显微镜评估细菌细胞形态。操作步骤严格按照Wang等人[20]的描述执行。

1.2.4 DAPI染色观察DNA

将菌株分别培养在LB和含有0.2 mmol/L NaHS的LB中，然后在0、1、2和2.5 mmol/L下进行H2O2压力处理1 h。无菌PBS清洗3次后收集沉淀。向沉淀中加入4%的多聚甲醛固定10 min，之后将沉淀重新悬浮于1 mL的无菌PBS中。将500 µL的DAPI（10µg/mL）染料和500 µL的菌液混合于黑暗中静置10 min。再用无菌PBS离心洗涤样品3次以防止DAPI残留。样品重新悬浮于无菌PBS中，滴加5 µL样品于无菌载玻片上涂抹均匀，在激光共聚焦显微镜下进行观察。

1.2.5 生物膜

1.2.5.1 结晶紫

隔夜培养的细菌分别用LB肉汤培养基和含有0.2 mmol/L NaHS的 LB肉汤培养基稀释至最终浓度1×106~2×106CFU/mL。将稀释的菌液（2 µL）分别添加到198 µL无菌LB肉汤和含有1、2和2.5 mmol/L H2O2无菌LB肉汤的96孔板中。在培养到24 h、48 h和72 h后，小心地移除培养基，并用无菌水冲洗三次，以去除自由漂浮的细菌；在室温下干燥1 h；用浓度为1%结晶紫对孔中的粘附细菌进行30 min的染色；用无菌水冲洗三次以去除多余的染剂。最后用33%的乙酸培养15 min，使结晶紫释放。用酶标仪测量每个孔在570 nm处的OD值。每组实验均进行三次。

1.2.5.2 扫描电子显微镜

将细胞爬片放入分别含有 1.98 mL LB、LB+1 mmol/L H2O2、LB+2 mmol/L H2O2和 LB+2.5 mmol/L H2O2的24孔板中。然后，吸取20 µL铜绿假单胞菌过夜培养物加入上述24孔板中，并将菌液与含有不同浓度H2O2的LB培养基混合，将孔板放置在37 ℃生化培养箱里培养24、48和72 h。在H2O2激发之前添加0.2 mmol/L NaHS作为实验组。在生物膜形成期间，每隔24 h用新鲜培养基替换旧培养基。培养至相应时间的细胞爬片用PBS清洗以去除浮游细胞，之后浸在1 mL 2.5%戊二醛中固定，在4 ℃下固定24 h后，细胞爬片用50%、70%、80%、90%和100%的乙醇脱水（每种浓度 30 min），经过冷冻干燥、镀金处理后，样品制作完成，最后用扫描电子显微镜进行检测观察。

1.2.5.3 激光共聚焦显微镜

使用激光共聚焦显微镜可以检测生物膜的存在。以与扫描电子显微镜检测相同的方式制备细胞爬片。当细胞爬片在 37 ℃下培养 24、48和 72 h后，用FITC-Con A及PI染剂对细胞爬片上形成的细菌生物膜进行染色，然后通过CLSM进行观察。

2 结果与讨论

2.1 0.2 mmol/L NaHS对铜绿假单胞菌生长状态的影响

图1a为空白组菌株（未添加硫化氢）和实验组菌株（添加0.2 mmol/L NaHS）在OD600下的生长曲线对照。一般来说，低浓度的H2S具有细胞保护作用，高浓度的H2S对微生物具有细胞毒性[12,21]。高浓度的硫化物通过抑制超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性，阻碍大肠杆菌、黑曲霉、意大利青霉菌和鲍曼不动杆菌等细菌的生长以及与细胞防御氧化应激相关的天冬氨酸酶[17,19]。如图1a所示，0.2 mmol/L NaHS对铜绿假单胞菌的生长状态没有显著影响。因此，可以更好地比较两组菌株在氧化应激下的情况。

2.2 氧化应激条件下NaHS对铜绿假单胞菌存活率的影响

图 1b~d为对照组菌株（未添加硫化氢）和实验组菌株（添加0.2 mmol/L NaHS）在氧化应激下（0、1、2和2.5 mmol/L H2O2）的存活率比较。H2O2是最常用的氧化剂，可在细菌中产生各种ROS，引起氧化应激并导致蛋白质、脂肪和DNA的损伤[22]，并且在某些条件下，对细菌细胞造成致命的杀伤[23-24]。如图1b~d所示，细菌的存活率随着时间的推移而降低；随着 H2O2浓度的增加，铜绿假单胞菌的存活率显著降低（p<0.01）：在处理时间分别为0.5、1和1.5 h时，当H2O2浓度为1 mmol/L和2 mmol/L时，实验组的存活率均显著低于对照组（p<0.01）；当时间为 1.5 h，H2O2浓度为2.5 mmol/L时，对照组和实验组的存活率极低且无明显的差异，有可能是长时间，高浓度的H2O2对细菌造成的氧化损伤过大，以致NaHS的存在对细菌的影响减少。特别值得注意的是，在各个时间段，实验组的存活率均显著低于对照组。与前人的实验结果类似[19]，因此可以认为H2S会加剧H2O2对铜绿假单胞菌的杀伤作用。

2.3 氧化应激条件下NaHS对铜绿假单胞菌细胞形态的影响

图2为对照组菌株（未添加硫化氢）和实验组菌株（添加0.2 mmol/L NaHS）在氧化应激下（0、1、2和2.5 mmol/L H2O2）的细胞形态比较。在没有氧化应激的情况下，两组菌株的细胞没有显著差异，菌体细胞结构完整，均呈杆状，表面光滑，一端有鞭毛。随着H2O2浓度的增加，两组菌株形态的改变逐渐加重，而且实验组比对照组更严重。当H2O2浓度为1 mmol/L时，细菌皱缩，鞭毛消失，细胞表面聚集着颗粒状物质，这可能是无机多磷酸盐（polyP）[25]。polyP是具有氧化应激能力的生物聚合物，能够防止氧化损伤、蛋白聚集，通过螯合金属离子降低自由基浓度，以及调节不同细菌的一般应激反应途径来提高细菌的氧化应激能力[26]。当H2O2浓度为2 mmol/L甚至2.5 mmol/L时，细菌开始破裂，可以观察到胞质外流的现象。

2.4 氧化应激条件下 NaHS对铜绿假单胞菌DNA的影响

DAPI是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，和双链DNA结合后可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，且核酸量越大，荧光强度越强[27]。如图3所示，在没有过氧化氢的压力下，两组的荧光亮度无明显区别。随着过氧化氢的浓度越来越大，实验组的荧光强度明显弱于对照组，即与对照组相比实验组的核酸含量要明显低，可能由于NaHS作用后铜绿假单胞菌细胞膜的通透性升高导致胞内核酸流失。

2.5 氧化应激条件下NaHS对铜绿假单胞菌生物膜的影响

生物膜是由微生物在自产基质的保护下形成的，通常附着在表面。在食品加工环境中，生物膜通过腐败和致病菌的传播危及产品安全[28]。细菌生物膜过去20年中在治疗传染病方面认识到的一个新的临床问题。与对标准抗生素治疗反应相对较好的浮游细菌引起的感染相比，生物膜形成细菌往往会引起慢性感染[29]。Walsh等[30]发现，二级过硫传感器BigR会影响生物膜相关基因的表达。

在结晶紫实验中，如图4所示，两种状态的菌株在24 h形成的生物膜量最少，在48 h达到最大生物膜量。在没有氧化应激的情况下，两组菌株的生物膜形成量相似。随着 H2O2浓度增加到 1 mmol/L和 2 mmol/L时，生物膜形成显著减少，值得注意的是，实验组菌株的生物膜形成少于对照组菌株，由此推断H2S增强了H2O2对铜绿假单胞菌的损伤。此外，可以看到2.5 mmol/L H2O2对铜绿假单胞菌造成致命的伤害，几乎不能形成生物膜。细菌生物膜的形成涉及到从未成熟到成熟结构的转变，包括可逆粘附、不可逆粘附、微菌落形成、成熟和分散[31]。在本研究中，通过扫描电镜重点观察了铜绿假单胞菌在细胞爬片上形成的不同阶段。如图5所示，在培养24 h时，生物膜没有很好地形成，并且在细胞爬片上观察到许多浮游细菌。培养48 h后，观察到细菌聚集成一团，具有成熟的空间结构。在培养72 h后，生物膜结构发生改变，生物膜分散。值得注意的是，随着 H2O2浓度的逐渐升高，铜绿假单胞菌生物膜逐渐减少。在相同 H2O2浓度下，与对照组相比，实验组的菌株形成的生物膜更少。在H2O2浓度为2.5 mmol/L时，菌株基本上没有形成生物膜，只有少数浮游细菌在细胞爬片上。激光共聚焦图像（如图6所示）显示生物膜的形成过程，在24、48、72 h的培养时间里，生物膜的厚度呈现先增加再减少的趋势，并且图片中红色代表的死菌数量逐渐增加。同时，随着 H2O2浓度的增加，生物膜形成能力逐渐降低且死菌的数量相应增加。在 2.5 mmol/L H2O2的处理条件下，在各个时间点，几乎都不形成生物膜，仅存少量散落的细菌。

3 结论

本实验以铜绿假单胞菌为研究对象，分别从存活率、细胞形态、生物膜等方面探讨外源硫化氢对氧化应激的作用。结果表明0.2 mmol/L NaHS能显著降低铜绿假单胞菌在氧化应激胁迫下的存活率和生物膜的形成，加重细胞形态的损伤和DNA的外渗。以上研究表明0.2 mmol/L NaHS能增强H2O2对铜绿假单胞菌的杀伤作用，为铜绿假单胞菌的防控提供新的思路。关于NaHS能增强H2O2对铜绿假单胞菌的杀伤作用的具体机制需要进行更深一步的研究。