金樱根质量控制方法提升研究及等级评价体系的建立

白璐 郭静 伍实花 赵毅 吴梦瑶 陈灿 龚云 李春 张鹏

〔摘要〕 目的 提升金櫻根药材的质量控制方法，对其进行安全性分析与等级评价。方法 对现行质量标准进行总结，改进薄层鉴别方法，建立特征图谱，并对含量测定方法进行研究;采用电感耦合等离子体质谱法测定其铅、镉、砷、汞、铜的残留量;利用SPSS统计软件对其进行聚类分析。结果 TLC鉴别方法各斑点清晰，分离度良好，可以区分真伪，建立的特征图谱有5个特征峰，指认1个特征峰;不同产地金樱根5种重金属平均含量分别为铅0.7 mg/kg、镉0.1 mg/kg、砷0.1 mg/kg、铜5.0 mg/kg，汞低于0.01 mg/kg;30批样品分为3类：1批特级，9批优质，20批合格。结论 本方法结果准确、简便、客观、重复性好，可用于药材的质量控制;不同产地重金属含量均在中国《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》规定范围内，处于安全水平;本研究所提出的3个等级规格药材的不同等级特性区分明显，实践中容易掌握，对药材的采收加工、销售流通及临床应用具有一定的指导和实践意义。

〔关键词〕 金樱根;薄层色谱;特征图谱;含量测定;安全性评价;等级评价

〔中图分类号〕R284.1       〔文献标志码〕A        〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.02.007

Improvement of quality control method and establishment of grade evaluation

system for Rose cymosa

BAI Lu1， GUO Jing1， WU Shihua1， ZHAO Yi1， WU Mengyao1， CHEN Can1， GONG Yun1， LI Chun2， ZHANG Peng1*

（1. Zhuzhou Qianjin Pharmaceutical Co.， Ltd.， Zhuzhou， Hunan 412007， China; 2. Institute of Chinese

Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

〔Abstract〕 Objective To improve the quality control method of Rose cymosa， and to carry out safety evalution and grade evaluation. Methods The statutory standard of Rose cymosa were summarized. The thin-layer chromatography （TLC） identification method was improved， the characteristic map was established， and the content determination method was studied. The residues of lead， cadmium， arsenic， mercury and copper in Rose cymosa were determined by inductively coupled plasma mass spectrometry （ICP-MS）. Cluster analysis of Rose cymosa was carried out using SPSS statistical software. Results The spots on TLC plate were clear and well-separated， which can be used to identify the authenticity. The established characteristic spectrum identified 5 characteristic peaks and identified 1 components. The average content of lead， cadmium， arsenic and copper was 0.7， 0.1， 0.1， 5.0 mg/kg， respectively， and mercury was less than 0.01 mg/kg. The 30 batches of samples were divided into 3 categories， 1 batch of super grade， 9 batches of high quality and 20 batches of qualified. Conclusion The proposed methods are accurate， simple， and objective， and can be used for quality control of Rose cymosa. The content of heavy metals in Rose cymosa from different areas was all within the limit prescribed in China’s Green Thade Standards Importing & Exporting Medicinal plants & Preparation， which was at a safe level. This research proposes three ranks of medicinal materials specifications for different features to distinguish clearly， and easy to master in practice， which has certain guidance and practical significance for the collection， processing， sales， circulation and clinical application of medicinal materials.

〔Keywords〕 Rose cymosa; thin-layer chromatography; characteristic spectrum; content determination; safety evaluation; grade evaluation

金櫻根为我国西南瑶族、苗族、壮药、土家族等多个少数民族的常用药材[1-5]，应用广泛，具有清热利湿、解毒消肿、活血止血、收敛固涩的功效。本品为蔷薇科植物金樱子Rosa laevigata Michaux、小果蔷薇Rosa cymosa Tratt.和粉团蔷薇R. multiflora var. cathayenisis Rehder & E. H. Wilson的干燥根和茎[6]。金樱根中主要含有三萜、黄酮、鞣质类成分，可治疗遗精、遗尿、痢疾泄泻、崩漏带下、子宫脱垂、痔疮、烫伤等，为妇科千金片、金鸡胶囊及广东凉茶等常用中药[7-9]。

金樱根的不同现行标准来源基本一致，仅湖南省和广西省标准收载了3个基原，药用部位分别为根及茎与根及根茎。其余地方标准仅收载了蔷薇科植物金樱子的干燥根一个来源，质量标准在各现行标准中仅有显微鉴别与以金樱根对照药材为对照的薄层色谱鉴别。本研究从定性、定量和安全性等方面全面提升了金樱根的质控方法，为金樱根的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1  主要仪器

ATS 4薄层色谱全自动点样仪（瑞士CAMAG公司）;ADC 2薄层色谱全自动展开仪（瑞士CAMAG公司）;Derivatizer薄层色谱全自动喷雾系统（瑞士CAMAG公司）;Visualizer 2薄层色谱数码成像系统（瑞士CAMAG公司）;TH-II薄层色谱显色加热器（上海科哲生化科技有限公司）;Waters e2695高效液相色谱仪、Waters 2998 PDA检测器（美国Waters公司）;iCAP RQ ICP-MS电感耦合等离子体质谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）;AB204-S电子天平、AB135-S电子天平（瑞士梅特勒公司）;KQ300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;A11分析型研磨仪（德国IKA公司）。

1.2  试药

金樱根对照药材（批号：12115-201306）购于中国食品药品检定研究院;蔷薇酸（Y-176-180516）购于成都瑞芬思生物科技有限公司;乙醇（批号：P1433419）、甲醇（批号：P1441123）、二氯甲烷（批号：P1454839）均购于General-Reagent公司;乙腈（批号：177798）购于Fisher公司;磷酸（批号20171008）购于天津市科密欧化学试剂有限公司;其他所用试剂均为分析纯。金樱根药材为株洲千金药业股份有限公司提供，共计30份，其标准收载情况及实验样品信息见表1和表2。

2 方法与结果

2.1  薄层鉴别

2.1.1  供试品溶液的制备  取本品粉末（过二号筛）1 g，置具塞锥形瓶，加95%乙醇10 mL，密闭，超声处理15 min，过滤，滤液作为供试品溶液。

2.1.2  对照品溶液的制备  取金樱根对照药材，同法制成对照药材溶液。取蔷薇酸对照品适量，加二氯甲烷-甲醇（1∶1）制成1 mg·mL-1的对照品溶液。

2.1.3  薄层色谱  依据薄层色谱法（中华人民共和国药典2015年版四部通则0502）试验，分别吸取对照品溶液1 μL、供试品溶液3 μL、对照药材溶液3 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷∶甲醇∶水（9∶1∶0.1）为展开剂，展开剂蒸汽饱和20 min后展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇（m/V），在105 ℃加热5 min，在365 nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。采用上述色谱法对24批不同产地（S1～S20）不同基原（S31～S33）和伪品（S35）药材进行薄层鉴别，结果样品中斑点清晰，比移值（Rf）合适，不同基原样品具有良好的一致性，可以达到区分伪品的目的。结果见图1。

2.2  特征图谱与含量测定

2.2.1  色谱条件与系统适应性  分别选用ACE Excel 3 C18-PFP色谱柱（4.6 mm×150 mm，3 μm）、Waters Xselect HSS PFP（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），甲醇（A）-乙腈（B）-0.1%磷酸水溶液（C）为流动相，梯度洗脱（0～10 min，5% A，15%～23% B，80%～72% C;10～23 min，5%A， 23% B，72% C;23～55 min，5%A， 23%～35% B，72%～60% C;55～62 min，5%A， 35%～39% B，60%～56%C;62～65 min，5% A， 39%～43% B，56%～52% C;65～80 min，5% A， 43%～55% B，52%～40% C;80～90 min，5% A， 55%～70% B，40%～25% C）;体积流量为1.0 mL·min-1;柱温为 30 ℃;检测波长为210 nm;进样量为10 μL。理论塔板数按蔷薇酸计算应不低于5000。供试品色谱中共呈现5个特征峰，与参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围以内。规定值为0.37（峰1）、0.43（峰2）、0.67（峰3）、1.00（峰4/S）、1.02（峰5）。检测结果与图谱见表3-4，图2。

2.2.2  参照物溶液的制备  取蔷薇酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每 mL含蔷薇酸0.15 mg溶液，即得。

2.2.3  供试品溶液的制备  取金樱根样品（批号S32、S33、S34），粉碎，過三号筛，约1.0 g，精密称定，置125 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，加热回流1 h，放冷，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

现行标准对金樱根缺少成分质控，仅以薄层鉴别作为定性鉴别，有学者采用ACE Excel 3 C18-PFP色谱柱建立了基于同一色谱条件的金樱根指纹图谱和含量测定[15]，但专属色谱柱耐用性窄，且实测过程中柱压过高，此次采用其他厂家色谱柱进行试验，扩充了色谱柱耐用性，新增了特征图谱检测，结果显示色谱柱耐用性良好，可提高检测效率，节约质量控制成本。

2.3  样品测定

取30批金樱根药材，按照药典通则及上述特征图谱和含量测定方法进行检测，结果如下表5-7。

结果显示，30批金樱根重金属及有害元素的含量中铅的含量在0.2～1.8 mg/kg、镉的含量在0.03～0.3 mg/kg、砷的含量在0.03～0.3 mg/kg、铜的含量在2.2～7.3 mg/kg、汞的含量均未超过0.01 mg/kg。均在中国《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》[16]规定限度内，处于安全水平。

蔷薇酸是金樱根的有效成分之一，也是金樱根质量评价的重要指标。通过对不同产地金樱根进行蔷薇酸的含量测定，结果表明金樱根蔷薇酸含量在0.25%～0.63%，说明不同产地的蔷薇酸含量存在差异。

30批金樱根直径范围1.1～5.9 cm，变异系数达到47.2%，说明不同产地金樱根直径大小存在较在差异，可通过感官鉴别可直接分辨大小。醇溶性浸出物的含量在12%～28%，均符合《湖南省中药材标准》（2009年版）对金樱根浸出物规定的限量标准（不少于10%）。

2.4  金樱根药材等级建立的研究

2.4.1  聚类指标的拟定与分级  考虑到传统药材采用“辨状论质”的原则，再结合药材关键质量属性，故选择直径、醇溶性浸出物、蔷薇酸含量作为金樱根药材分级指标。

2.4.2  分级  将每份金樱根样品的直径、浸出物、含量作为聚类指标，运用SPSS 19.0统计分析软件对30批金樱根样品进行分析，结果见图3。

由图3可以看出，可将30批金樱根样品分为3类：样品S16聚为一类，为一等品;样品S1、S3、S6、S12、S17、S21、S25、S26、S29聚为一类，为二等品;其他20份样品聚为一类，为统货样品。汇总分析见表8。

同时结合各样品产地及含量结果情况分析，一等品1批，分布产地为湖南吉首（1批）;二等品共9批，分布产地为湖南吉首（6批）、湖南张家界（1批）、广西桂林（1批）、贵州铜仁（1批）;二等品等级以上产地主要分布在湖南省、广西省、贵州省。

3 讨论

金樱根为常见药材，但在各省收载的质控标准简单，多以性状鉴别为主，仅少量含有薄层鉴别[6，10]，不仅方法的前处理过程较为复杂、耗时，而且不环保，本研究从提取溶剂、提取方式、展开剂方面对薄层鉴别方法作了优化筛选，且增加活性成分蔷薇酸作为对照，对影响薄层鉴别的主要因素如不同薄层板的比较、展开温度、湿度等进行考察，发现薄层板的种类、温湿度对分离效果影响均较小，优化后的方法展开斑点数目较多且清晰，分离效果好，Rf值重复性好，可以区分伪品，对金樱根药材具有较好的鉴别效果。

金樱根主要含三萜、黄酮、鞣质类成分，其中质控成分蔷薇酸与委陵菜酸同为三萜类同分异构体，较难分开，故文献采用五氟苯基混合键合在超高纯碱基去活硅胶基的PFP-C18柱[15]，兼顾C18与五氟苯基的双重特点，具有独特的选择性，相对于其他普通C18柱有明显的优势，但专用色谱柱柱压高，检验成本高，实验中尝试不同厂家不同规格PFP色谱柱，包含SHIMADZU Shim-pack Scepter PFPP-120 （150 mm×4.6 mm，3 μm）、菲罗门 Titank F5（150 mm×4.6 mm，3 μm）、Waters Xselect HSS PFP（250 mm×4.6 mm，5 μm）、CAPCELL PAK PFP （250 mm×4.6 mm，5 μm），经过多批次多基原样品测定，最终确定Waters Xselect HSS PFP（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）色谱柱检测结果与文献[15]报道色谱柱结果一致，拓展了色谱柱的耐用性，所测定结果均一致，并根据实测结果建立金樱根药材的特征图谱，在一定程度上丰富了金樱根药材的鉴别方法，为其质量控制提供参考，提高了金樱根的质控标准。将不同产地金樱根按照提升后的质控方法进行检验，采用聚类分析法对30批金樱根药材进行等级评价，对中药材的等级标准进行有益尝试，结果显示，不同省份的不同批次样品质量波动较大，而湖南省样品优质且不同批次质量较稳定。

本研究从药材的特征性成分出发，分别从定性和定量两个方面对金樱根药材进行质量评价，结合传统的中药材分级方法和现代科学方法，制定一套金樱根药材完整的评价方法，达到提升该药材质量标准的目的。本方法结果准确、简便、客观，重复性好，可用于药材的质量控制;不同产地重金属含量均在中国《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》规定范围内，处于安全水平。本研究所提出的3个等级规格药材的不同等级特性区分明显，实践中容易掌握，对药材的采收加工、销售流通及临床应用具有一定的指导和实践意义。

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