大血藤煎剂对慢性盆腔炎大鼠子宫TGF-β/Smads通路的影响研究

江 璠,陈寿珍

(厦门市海沧医院妇科,福建 厦门 361000)

慢性盆腔炎(CPID)是由于生殖器官及其周围组织发生的慢性炎症性病变[1]。CPID由于疾病反复发作,迁延不愈,可导致患者出现输卵管不孕、慢性骨盆疼痛以及宫外孕等,对女性生活质量造成了严重影响[2]。大血藤又名红藤,是木通科植物大血藤的干燥藤茎,具有清热解毒、活血通络、祛风止痛等作用,对妇科血瘀诸证以及风湿痹痛均有较好的治疗作用[3]。为了进一步明确大血藤对慢性盆腔炎的治疗作用及其可能的作用机制,本研究探讨分析大血藤煎剂对慢性盆腔炎大鼠子宫TGF-β/Smads通路的影响,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 药材

大血藤购于安徽省,经鉴定为木通科植物大血藤的藤茎。取大血藤重量的10倍水进行药材提取,提取3次,每次提取时间为2h,浓缩干燥后粉碎称重,使用时用0.5%CMC-Na配置成混悬液。

妇科千金片(株洲千金药业股份有限公司,国药准字Z43020027)

1.2 动物

SD雌性大鼠70只,SPF级,体质量(200±20)g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司(SCXK(京)2012-0001)。实验前将动物适应性饲养3d,饲养温度18～25℃,恒定湿度,动物标准饲料、自由饮水、分笼饲养。

1.3 主要试剂及仪器

戊巴比妥钠(上海上药新亚药业有限公司,H31021724);苯酚(上海阿达丁生化科技股份有限公司,CAS: 108-95-2);IL-6 ELISA试剂盒(美国Abcam,ab234570);TNF-α ELISA试剂盒(美国Abcam,ab236712);TRIzol试剂(美国Invitrogen,10296010);逆转录试剂盒(美国Invitrogen,18091050);RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技术有限公司,P0013B);极超敏ECL化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,P0018FS);TGF-β1抗体(美国Abcam,ab229856);TGF-β3抗体(美国Abcam,ab15537);Smad3抗体(美国Abcam,ab40854);Smad7抗体(美国Abcam,ab216428);电子分析天平(德国Sartorius公司,BA110S型,万分之一精确度)。

1.4 方法

1.4.1 慢性盆腔炎大鼠造模

使用30mg/kg戊巴比妥钠静脉麻醉大鼠,将腹部正中毛剪去,75%酒精消毒,下腹部正中行2cm切口,暴露子宫,从大鼠子宫分岔处,将0.1mL注射器插入子宫腔内,针头转向右侧子宫,缓慢推注0.06mL 25%苯酚胶浆,将左侧子宫作为自身对照,关闭腹腔,术区消毒。

1.4.2 分组及处理

将70只大鼠随机分为7个组,分别为:对照组、假手术组、模型组、高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性药物组。其中对照组正常饲养,假手术组仅开腹和闭腹,不进行苯酚胶浆注射。造模成功后,高、中、低剂量组以及阳性药物组分别给予8g生药/kg、4g生药/kg、2g生药/kg以及妇科千金片(1.13g/kg),按照10mL/(kg·d)灌胃,其中假手术组以及模型组给予等量生理盐水灌胃,各组大鼠连续灌胃3周。

1.5 观察指标

于术后22d,使用30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠,使用负压管于腹主动脉取血3～4mL,分离血清。采用ELISA法检测各组大鼠血清IL-6以及TNF-α表达水平。

摘取大鼠左侧、右侧子宫,并计算子宫肿胀率。子宫肿胀率=(致炎侧子宫质量-未致炎侧子宫质量)/未致炎侧子宫质量×100%。

取各组大鼠右侧子宫组织,用生理盐水清洗后,将其分为两块,取其中一块子宫组织,用锡箔纸包裹后迅速置于-80℃冰箱内迅速冰冻,采用RT-PCR法检测各组大鼠子宫组织内TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7 mRNA表达。采用TRIzol试剂提取组织总RNA,按照逆转录试剂盒使用说明书将其逆转录为cDNA。引物序列为:TGF-β1:上游引物5’-CACTCCCGTGGCTTCTGTG-3’,下游引物5’-GGACTGGCGAGCCTTAGTTT-3’;TGF-β3:上游引物5’-GGACTTCGGCCACATCAAGA-3’,下游引物5’-TGATAGGGACGTGGGT CAT-3’;Smad3:上游引物5’-GGGAGACATTTCCACGCTTCG-3’,下游引物5’-CCTTGTAAG CTCCCACGGCTG-3’;Smad7:上游引物5’-CGGAAGTCAAAGAGGGCTGTGT-3’,下游引物5’-CGTCTGGACAGTCTGCAGTT-3’;β-actin:上游引物5’-CCCATCTATGAGGGTTA CGC-3’,下游引物5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。扩增结束后,取反应物上机进行凝胶电泳检测,以β-actin作为内参基因,采用2-△△Ct法计算各目的基因相对表达。

取另外一块子宫组织采用Western blot检测,研碎后采用RIPA蛋白裂解液提取大鼠子宫组织总蛋白,取20μg蛋白上样,进行SDS-PAGE电泳,电泳结束后进行PVDF转膜,之后5%脱脂奶粉封闭,一抗4℃孵育过夜,二抗37℃孵育1h,TBST清洗后,采用ECL试剂盒显色,曝光、拍照。结果用目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示,采用ImageJ软件对显影条带进行分析。

1.6 统计学分析

采用统计学软件SPSS 25.0进行数据处理分析,多组间计量资料比较采用方差分析,两组间计量资料比较采用t检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠子宫肿胀程度比较

与对照组及假手术组比较,其余各组大鼠右侧子宫明显肿胀(P<0.05),而大血藤高、中、低剂量组及阳性药物组子宫肿胀程度较模型组降低(P<0.05),且随着大血藤药物浓度的增加,大鼠右侧子宫肿胀度显著降低(P<0.05),见表1。

表1 各组大鼠子宫肿胀程度比较

2.2 各组大鼠血清炎症因子水平比较

与对照组及假手术组比较,其余各组大鼠血清IL-6及TNF-α水平均升高(P<0.05),而大血藤高、中、低剂量组及阳性药物组大鼠血清IL-6及TNF-α较模型组降低(P<0.05),且随着大血藤药物浓度的增加,大鼠血清IL-6及TNF-α水平降低(P<0.05),见表2。

表2 各组大鼠血清炎症因子水平比较

2.3 各组大鼠子宫TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7表达比较

与对照组及假手术组比较,其余各组大鼠子宫TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7蛋白均升高(P<0.05),而大血藤高、中、低剂量组及阳性药物组大鼠子宫TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7蛋白表达较模型组降低(P<0.05),且随着大血藤药物浓度的增加,大鼠子宫TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7蛋白表达水平降低(P<0.05),见表3。

表3 组大鼠子宫TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7蛋白表达比较

2.4 各组大鼠子宫TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7 mRNA比较

与对照组及假手术组比较,其余各组大鼠子宫TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7 mRNA相对表达量均升高(P<0.05),而大血藤高、中、低剂量组及阳性药物组大鼠子宫TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7 mRNA相对表达量较模型组降低(P<0.05),且随着大血藤药物浓度的增加,大鼠子宫TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7 mRNA相对表达量降低(P<0.05),见表4。

表4 各组大鼠子宫TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7 mRNA比较

3 讨论

盆腔炎症可表现为一个局部症状,也可同时累积多个部位,其中以卵巢炎、输卵管炎最为常见。盆腔炎主要在性生活活跃期以及有月经的妇女中高发,若未得到及时、彻底的治疗,可能导致患者出现输卵管异位妊娠、炎性反应反复发作、慢性盆腔疼痛以及不孕症等,严重影响女性的生殖健康[4-5]。慢性盆腔炎是由于患者发生急性盆腔炎后的一种后遗症,是由于急性盆腔炎后促炎/抗炎因子相互作用,同时局部免疫调节共同参与的引发的[6]。由于患者机体免疫系统受到破坏,抗病能力明显降低,盆腔更容易受到厌氧菌或需氧菌混合感染,导致机体炎性细胞浸润,进一步加重病情,而对盆腔组织造成影响[7]。目前,西医对于慢性盆腔炎的治疗,主要以抗菌药物治疗为主,但是治疗疗效不佳、治疗副作用大,且患者长期使用容易产生耐药性,而中医药对于慢性疾病的治疗具有标本兼治、副作用小等优势[8]。

中医学认为,盆腔炎发生主要是由于机体气血运行不畅、胞宫经血受阻,不通则痛,或由于冲任胞宫失于濡养,不荣则痛[9]。因此,对于慢性盆腔炎的治疗关键在于“活血化瘀”。大血藤药性苦、平,归大肠、肝经,可清热解毒,活血止痛,临床上多用于妇科盆腔炎的治疗。为了进一步了解大血藤治疗慢性盆腔炎的机制,本研究使用慢性盆腔炎大鼠进行研究分析。

IL-6是单核细胞以及血管内皮细胞所产生的一种炎症细胞因子,IL-6可诱导炎症反应,造成组织细胞的进一步损伤;TNF-α则是一种可诱导机体特异性免疫反应以及天然免疫反应的重要介质,可激活巨噬细胞,从而诱导炎症反应。本研究结果显示,造模后各组大鼠血清IL-6以及TNF-α水平显著升高,同时大血藤煎剂可有效降低慢性盆腔炎模型大鼠子宫肿胀程度以及血清IL-6以及TNF-α表达水平,提示了慢性盆腔炎模型造成成功,同时大血藤对慢性盆腔炎的治疗可能通过抑制炎症介质以及炎症因子的表达,调节机体免疫功能有关。与学者研究报道结果相似[10]。

TGF-β是一类具有多种调控功能的多肽生长因子家族,研究显示,炎症反应可激活机体内TGF-β家族表达,从而诱导细胞黏连蛋白的合成和分泌,而Smads是TGF-β信号转导中唯一的底物蛋白。学者研究报道显示[11],在CPID患者中出现TGF-β/Smads信号通路的异常表达,提示TGF-β/Smads通路参与到了CPID疾病的进展中。本研究结果显示,大血藤高、中、低剂量组及阳性药物组大鼠子宫TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7蛋白及mRNA相对表达量较模型组降低,且随着大血藤药物浓度的增加,大鼠子宫TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7蛋白及mRNA相对表达量降低。提示大血藤对于慢性盆腔炎大鼠的治疗,可能与抑制大鼠子宫TGF-β/Smads通路表达有关。

综上所述,大血藤煎剂可有效降低慢性盆腔炎大鼠子宫肿胀,其作用机制可能包括抑制大鼠及炎症反应以及抑制TGF-β/Smads信号通路。