miR-492在舌鳞癌增殖与转移中的作用

蒋琳，武媛，黄文泉，郭建徕，邵益森，王伟

（江西中医药大学附属医院口腔创伤整形科，南昌 330006）

舌鳞癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，近年来患病率呈升高趋势，但目前临床上缺乏行之有效的靶向治疗手段，同时该病发生发展的分子机制未能深入阐述。

miRNA是一种长度在17-25 nt的单链非编码RNA，它们广泛存在于真核细胞中，能通过降解靶mRNA或抑制其翻译等手段，来调节细胞增殖、分化与凋亡，参与个体发育、机体代谢以及肿瘤发生发展等过程[1]。研究显示miRNA既可作为原癌基因参与恶性肿瘤的发生和发展过程，又可作为抑癌基因参与恶性肿瘤的形成，其在肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡和机体发育、代谢等基本生命活动过程中发挥重要作用[2-3]，并可以作为肿瘤早期诊断和治疗的生物标志物。

miR-492在多种肿瘤中均被发现表达异常，如宫颈癌、肝癌等。同时也有研究发现miR-492同肿瘤的化疗耐药有关。目前关于miR-492与舌鳞癌的相关研究未见报道。本研究拟探索miR-492在舌鳞癌组织中的表达及其同舌鳞癌患者临床病理之间的关系，探讨miR-492调控舌鳞癌增殖及侵袭转移的机制，以期为舌鳞癌的治疗提供新的思路，寻找新的治疗靶点。

1 材料和方法

1.1 临床标本收集52例舌癌组织和24例癌旁组织（2 cm外舌体组织）标本均来自江西中医药大学附属医院口腔科，患者手术时间2014年7月-2020年7月。患者为初发舌癌且全身检查未发现远处转移，术前未行放化疗及其他治疗，手术方式均为舌颌颈联合根治术。所有入选病例术后均得到组织病理确认。手术切除的标本立即放入液氮，在液氮中长期保存。

1.2 组织总RNA提取 组织样本的提取采用RecoverAll总核酸提取试剂盒（Ambion，USA）提取肿瘤组织及正常组织总RNA，SmartSpec Plus分光光度计（Bio-Rad，USA）对总RNA进行定量。

1.3 cDNA合成与qRT-PCR取100 ng总RNA按操作说明书进行反转录cDNA，反应程序：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min。按Taqman MicroRNA Assays（Applied Biosystems，USA）说明检测成熟的miRNA，以miR-492和U6作模板，miR-492和U6荧光探针作引物扩增，反应程序为：95℃45 s，95℃15 s，60℃15 s，45个循环，所有试验重复3次。

1.4 构建过表达和抑制表达舌鳞癌细胞系 该实验选用舌鳞癌细胞株UM1，UM2细胞株，用含10%FBS的DMEM/F12培养基培养UM1和UM2，置于37°C恒温、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养，待细胞铺满80%镜下视野时用0.25%含EDTA胰酶消化传代。所有细胞复苏后常规传代两次，取生长状态良好的细胞用于后续实验。miR-492 mimics及LNA购买于上海吉玛公司，按照siPORT TM NeoFX TM转染试剂（Ambion USA）说明书转染物进入舌鳞癌细胞系，miR-492 mimics和control mimics分别加入UM2细胞系，至终浓度45 nmol/L，24 h后，qRT-PCR检测mi R-492的表达水平；miR-492 LNA和miR-492 LNA negative control组分别加入UM1细胞系，至终浓度45 nmol/L，24 h后，qRTPCR检测miR-492的表达水平。

1.5 细胞增殖检测 转染细胞及对照舌鳞癌细胞铺于96孔板，待细胞密度长至3×104/每孔加MTT溶液（5 mg/mL）20μL。继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，选择570 nm波长，MTT法实验重复3次。

1.6 细胞迁移检测 待转染细胞及对照舌鳞癌细胞生长至对数生长期时，消化离心后用无血清的培养基重悬细胞，将含有1×105个细胞悬液加入不含基质胶的小室，小室下层置5%血清培养基，孵育24小时后，棉签轻轻擦去小室内未迁移的细胞，4%多聚甲醛固定10 min，DAPI染色10 min，单蒸水洗涤后风干，于倒置显微镜下观察，拍照，每组细胞重复三次实验。

1.7 细胞侵袭检测 基质胶孵育Transwell小室24小时后，实验步骤同细胞转移检测实验。

1.8 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，数据以（±s）表示，采用单因素方差分析比较多项指标。计量资料组间比较采用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 mi R-492在癌旁正常组织及舌鳞癌组织中的表达情况qRT-PCR检测结果显示，miR-492在舌鳞癌组织中表达高于正常组织，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

图1 癌旁正常组织及舌鳞癌组织中miR-492的表达情况（N:正常舌体组织，TSCC：舌鳞癌组织）

2.2 mi R-492的表达与舌鳞癌患者的临床病理特征的关系miR-492的表达与T分期、临床分期、淋巴结是否转移、肿瘤分化程度均有相关性，差异具有统计学意义。见图2。

2.3 miR-492在不同舌鳞癌细胞株中的表达 结果显示：miR-492在舌鳞癌细胞（UM1，UM2）中表达高于正常细胞（HaCat），miR-492在UM1中表达较高，在UM2中表达较低。

图2 miR-492的表达与舌鳞癌患者的临床病理特征的关系（A）舌鳞状细胞癌患者组织标本中T3+4的miR-492表达显著高于T1+2；（B）舌鳞状细胞癌患者组织标本中临床分期CIII+IV的miR-492表达显著高于临床分期CI+II；（C）颈淋巴结转移阳性舌鳞状细胞癌患者的miR-492表达显著高于颈淋巴结转移阴性患者；（D）舌鳞状细胞癌患者组织标本中病理分级为中低分化的miR-492表达显著高于高分化病理分级。＊＊P＜0.05。

图3 miR-492在不同舌鳞癌细胞株中的表达情况

2.4 沉默miR-492对舌鳞癌细胞体外增殖侵袭转移能力的影响 为探讨舌鳞癌细胞沉默miR-492后对增殖，侵袭迁移能力的影响，我们采用mi R-492 LNA抑制UM1细胞mi R-492的表达，结果显示：UM1经miR-492 LNA处理后细胞的OD值较对照组明显降低，说明细胞增殖能力减弱（P<0.05）（图4A）；迁移实验结果显示：miR-492 LNA组穿膜细胞数目较对照组显著下降，说明其迁移能力明显受到抑制（P<0.05）（图4B）；侵袭实验结果显示：miR-492 LNA组穿膜细胞数目较对照组显著下降，说明其侵袭能力亦明显受抑制（P<0.05）（图4C）。

2.5 过表达mi R-492对舌鳞癌细胞体外增殖侵袭转移能力的影响 为进一步探讨舌鳞癌细胞过表达miR-492后对增殖，侵袭迁移能力的影响，我们采用miR-492 mimics使UM2细胞中mi R-492的表达上调，结果显示：UM2经miR-492 mimics处理后细胞的OD值较对照组明显升高，说明细胞增殖能力增强（P<0.05）（图5A）；迁移实验结果显示：mi R-492 mimics组穿膜细胞数目较对照组显著升高，说明其迁移能力明显增强（P<0.05）（图5B）；侵袭实验结果显示：miR-492 mimics组穿膜细胞数目较对照组显著升高，说明其侵袭能力亦明显增强（P<0.05）（图5C）。

图4 沉默miR-492对舌鳞癌细胞体外增殖侵袭转移能力的影响（A）舌鳞状细胞株UM1经miR-492 LNA处理后，与对照组相比，细胞的OD值下降，增殖能力减弱；（B）UM1细胞的迁移能力（C）和侵袭能力（D）明显受到抑制。＊＊P＜0.05。

图5 过表达miR-492对舌鳞癌细胞体外增殖侵袭转移能力的影响（A）舌鳞状细胞株UM2经miR-492 mimi cs处理后，与对照组相比，细胞的OD值升高，增殖能力增强；（B）UM1细胞的迁移能力（C）和侵袭能力（D）明显增强。＊＊P＜0.05。

3 讨论

miRNA是一类长度为17-25nt的单链非编码RNA，通过与靶基因mRNA互补位点的结合在转录后水平调控靶基因的表达[4]。除了被人们所熟知的细胞质miRNA之外，miRNA也存在于细胞的膜结合区如分泌性小泡[5-6]和线粒体[7-8]中。人类细胞中约1/3的蛋白编码基因受到miRNA的调控。因此miRNA与它们的标靶分子组成了一个复杂的调控网络，控制机体的重要生命活动。越来越多的研究表明，miRNA具有原癌基因或者抑癌基因的作用，在细胞的生长、增殖和凋亡过程中发挥着重要作用，其表达水平的异常与许多肿瘤的发生发展密切相关。

miR-492已经在多种恶性肿瘤中被发现同肿瘤发生发展相关。有国外学者研究表明肝细胞癌中miR-492的表达在肝癌组织中表达升高，在正常组织中表达降低，而且通过mi R-492-PTEN-AKT途径调控肝癌的进展[9]。段永恒等采用Affymetrix miRNA 4.0芯片筛查宫颈癌淋巴结转移患者发现，相对于未转移患者，转移患者中miR-658和miR-492上调最为显著[10]。亦有学者报道，在一些肿瘤中miR-492的表达降低。在肾透明细胞癌中，miR-492的表达较正常组织低[11]。有研究发现在前列腺癌复发患者中miR-492的表达较原发前列腺癌患者的表达降低[12]。刘长征等学者指出，在肝内及肝外胆管癌中，miR-492同其他5个miRNA的表达均降低[13]。与此同时，有学者的研究发现肝癌、肝脏良性肿瘤患者以及正常人血清中的miR-492的表达差异无统计学意义[13]。

尽管对于miR-492在不同肿瘤中的表达的研究结果各异，在机制方面仍然需进一步的研究。目前已经有多篇文献报道了miRNA与肿瘤化疗耐药的相关性。有学者探讨了miR-492在结肠癌细胞LS174T奥沙利铂耐药中的作用，结果显示：与LS174T细胞相比较，耐药细胞中mi R-492表达减少，其可能通过调节CD147的表达调控结肠癌细胞的奥沙利铂耐药[14-15]。

舌鳞癌是头颈鳞状细胞癌中最常见的种类，因其具有较强的侵袭性且死亡率较高，因而从分子层面出发的治疗手段相关的研究具有重要的临床意义[16]。目前miR-492与舌鳞癌的相关行研究未见报道。本课题组的前期研究显示miR-492在舌鳞癌组织中高表达，在正常舌体组织中低表达。

miRNA在肿瘤中的调控网络较为复杂，本课题组的研究显示miR-492的过表达可以促进舌鳞癌细胞的增殖、侵袭和转移，而miR-492表达的抑制可以导致舌鳞癌细胞增殖、侵袭转移能力的降低，提示miR-492参与到舌鳞癌细胞的生物学行为的调控。但是其中具体的机制尚且不明。

综上所述，本研究显示，miR-492具有促进舌鳞癌细胞发生发展的作用，下调表达能抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移，反之，上调其表达能促进肿瘤细胞的相关生物学行为。miR-492是参与舌鳞癌生物学行为的靶点。