犊牛源雷氏普罗威登斯菌的分离鉴定及药物敏感性试验

王 娜，戴伶俐，乌云塔娜，毕力格，赵世华，达来宝力格

（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；2呼伦贝尔市新巴尔虎右旗动物疫病预防控制中心，内蒙古 新巴尔虎右旗 021300；3.呼伦贝尔市新巴尔虎右旗农牧业事业发展中心，内蒙古 新巴尔虎右旗 021300）

1904年美国细菌学家RETTGE初次分离到雷氏普罗威登斯菌（Providencia rettgeri），为肠杆菌科，普罗威登斯菌属［1］。该菌为人畜共患条件病原菌，通过菌毛黏附于生殖道上皮引起尿路感染，也可引起伤口感染、菌血症、腹泻等多种疾病［1-2］。此外，雷氏普罗威登斯菌也能污染食品，造成人食物中毒，并能引发感染性腹泻［3-4］。

雷氏普罗威登斯菌可感染多种动物，如虾、鼠、羊、猪、龟、扬子鳄等。1997年我国学者战文斌等［5］首次从患病虾中分离到3株雷氏普罗威登斯菌，该菌致病性强，可引发败血病；2012年王建峰等［6］从外来船舶压舱水中分离到该菌；2015年王建昌等［7］从美国种猪新鲜粪便中分离到该菌，且该菌未携带blaNDM-1耐药基因；2015年李林俐等［8］从扬子鳄分离到该菌，扬子鳄感染该菌会出现精神萎靡、便血，严重者甚至会出现败血症；2016年Benedict等［9］从发病的鳄鱼中也分离到了2株雷氏普罗威登斯菌，这2株菌均能引发败血症，且具有较强的耐药性；2016年刘琨［10］从病死竹鼠内脏中分离该菌，竹鼠感染该菌后肺部出现肿胀，肠道有出血点，脾和肝存在结节；2016年芮萍等［11］从哺乳腹泻仔猪肠拭子中分离到该菌，该菌对13种药物表现为耐药，仅对美罗培南、乙酰甲喹敏感。2018年曹瑞勇等［12］从发病黑山羊鼻拭子中分离到该菌；2018年Newton等［13］从15岁短毛家猫中首次分离到该菌，该菌致病性强，可引发腹泻、发烧、胆囊炎、肝炎等病症，口服普拉多沙星治疗28 d，之后4个月无并发症状；2020年Ye等［14］从中国患病海龟中分离到致病性雷氏普罗威登斯菌，该菌含有多种致病因子、毒力因子及多重耐药基因。

该研究从腹泻犊牛肛拭子中分离到1株雷氏普罗威登斯菌，并进行药物敏感实验，为犊牛腹泻疾病的诊断提供理论依据，为后期的群体治疗提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 待检病料

从内蒙古呼伦贝尔市新巴尔虎右旗某家庭牧场1头腹泻犊牛中无菌采集肛拭子1份，装入采样袋，将其编号为HM-C-1。

1.1.2 试验试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；TSA和TSB培养基，美国BD有限责任公司；EMB培养基和血平板，广东环凯有限责任公司；革兰染色液，北京索莱宝科技有限公司；17种药敏片，杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.1.3 仪器设备

生化培养箱SPX-16B，吉林省安可科技有限责任公司；高速离心机pico17，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；恒温水浴锅SH-WB-6GDN3，韩国三兴有限责任公司；恒温摇床TS-2112B，上海比朗仪器制造有限公司；旋涡振荡器VM-10，大韩科学有限公司；PCR仪ABI9902，电泳仪HE99X，全自动凝胶成像仪Type T2A，美国伯乐有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离培养

无菌条件将肛拭子接种于血平板、TSA平板、EMB平板，37℃培养16～24 h，挑取菌落镜检纯化，纯培养物接种TSB中，取1 mL提取基因组DNA，剩余菌液用60%的甘油1∶1保存。

1.2.2 菌株生理生化鉴定

参照文献［10］［12］［15］对分离菌株进行生化指标的测定。将对数期的细菌浓度调整为108CFU/mL，取60μL菌液悬空加入各微量生化反应管，37℃培养24 h，观察结果。

1.2.3 菌株16Sr DNA鉴定

使用细菌基因组提取试剂盒提取菌株DNA，引物27 F和1492 R根据文献［8］由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR扩增体系为50μL：mix酶25μL，上下游引物各1μL，模板2μL，无酶水21μL。PCR反应条件：94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，30次循环；72℃7 min。PCR产物低温寄送到生工生物工程（上海）股份有限公司。

利用NCBI数据库进行序列比对，利用软件MegAlign构建菌株系统发育树。

1.2.4 药敏试验

使用17种药敏片进行体外抑菌试验，每种药敏片设置3个重复，参考CLSIM100（2020）标准进行结果判定，见表1。

表1 17种药敏片体外评价标准

2 结果与分析

2.1 菌株培养特性

该菌株在血琼脂平板、TSA平板、EMB平板上生长良好，在血琼脂平板为灰白色透明菌落，且无明显的溶血环，表面光滑，圆形凸起，边缘整齐（见图1A）；在TSA平板为白色透明菌落，表面圆形，湿润凸起，边缘整齐（见图1B）；在伊红美蓝琼脂平板为半透明淡棕菌落，表面圆形凸起，湿润光滑（见图1C）；挑取纯化菌落进行革兰染色，用1 000倍油镜观察为革兰阴性杆菌，并将该菌株命名为HMC-1。

图1 分离菌株HM-C-1的菌落形态

2.2 菌株生化鉴定结果

严格按照细菌新型生化鉴定管使用说明书进行操作。由表2可知，分离菌株氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶为阴性，硝酸盐还原试验、苯丙氨酸脱羧酶为阳性，符合雷氏普罗威登斯菌的理化特性，初步判断为雷氏普罗威登斯菌。

表2 菌株HM-C-1生化鉴定结果

2.3 菌株16Sr DNA鉴定

以菌株HM-C-1基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得1 500 bp的扩增产物（见图2），经生工生物工程（上海）股份有限公司测序，通过NCBI比对构建系统发育树（见图3）及进行同源性分 析 （见 图 4）， 分 离 株 HM-C-1与MT793534.1Providencia rettgeri相似度达到99.9%，因此，鉴定菌株HM-C-1为雷氏普罗威登斯菌。

图2 菌株HM-C-1 PCR产物扩增电泳图

图3 菌株HM-C-1的系统发育树

图4 菌株HM-C-1序列同源性分析

2.4 药敏试验结果

体外药敏试验显示，分离菌株HM-C-1对氨曲南、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢曲松、四环素、氯霉素、呋喃妥因8种药物表现为耐药；对氨苄西林、庆大霉素2种药物表现为中度敏感；对头孢西丁、链霉素、哌拉西林、阿米卡星、氧氟沙星、诺氟沙星、左氧氟沙星7种药物表现为敏感（见表3）。

表3 菌株HM-C-1体外药敏试验结果

3 讨论

试验通过菌株分离培养、生理生化试验及分子生物学技术确定该菌为雷氏普罗威登斯菌，曹瑞勇等［12］也是采用上述3种方法相结合进行菌株鉴定。目前，国内未报道犊牛源雷氏普罗威登斯菌，但该试验从发病犊牛肛拭子中分离到该菌，是引起犊牛腹泻的主要病原菌，且该病原可能是由于牛马混群饲喂导致交叉感染。尽管该菌为条件致病菌，但养殖过程中随着产业的集约化，养殖密度增大，外加各种冷热应激及营养供给不足，致使犊牛自身免疫力下降，极可能会使该菌乘虚而入，导致大批犊牛发病甚至死亡，给养殖场带来较大的经济损失，

考虑牧户养殖过程中滥用抗生素，细菌极可能产生耐药性，所以笔者设计体外药敏试验。该分离株对头孢西丁、链霉素、哌拉西林、阿米卡星、氧氟沙星、诺氟沙星、左氧氟沙星7种药物敏感；李林俐等［8］分离的扬子鳄源雷氏普罗威登斯菌对阿米卡星、氧氟沙星、诺氟沙星、氯霉素等14种药物敏感；刘琨［10］分离的竹鼠源雷氏普罗威登斯菌对头孢曲松、头孢他啶、氧氟沙星、环丙沙星、氟苯尼考和阿米卡星6种药物敏感；芮萍等［11］分离的仔猪源雷氏普罗威登斯菌仅对美罗培南、乙酰甲喹敏感。综合分析，每株菌的耐药程度不同，养殖过程中如发生该病，应根据药敏试验结果科学用药，方能获得较好的治疗效果。