基于网络药理学探讨荔枝核“异病同治”胃癌和肝癌的作用机制▲

尹硕鑫 卢 鑫 王舒萍 李安过 邱薛竹 李升驰 黄鸿翔 张 涛 陈远能

(1 广西中医药大学研究生院，广西南宁市 530000；2 广西中医药大学附属瑞康医院消化内科，广西南宁市 530011)

胃癌的致病因素复杂，环境和遗传因素都可能对其发生和发展产生影响[1]。尽管在过去的几十年里，胃癌的新发和死亡病例数均较前减少，但它仍是全球范围内第5大常见癌症和第4大常见癌症死亡原因[1]。近年来，肝癌的病死率超过胃癌，已成为全球范围第3大癌症死亡原因[2]。肝癌的发病危险因素主要有病毒性肝炎、酒精性肝病、代谢性肝病和长期接触毒素[3]。虽然我国对乙肝和丙肝的防控已经使部分地区的肝癌发病率明显降低，但由于人口基数大，每年新确诊的肝癌患者数量仍居高不下[4]。胃癌和肝癌早期缺乏特异性症状，因此多数患者确诊时常已处于癌症中晚期，常规西医治疗效果欠佳。中医药在癌症的防治中发挥着至关重要的作用，其能提高西药的疗效，且药物副作用小，可改善患者生活质量[5-6]。此外，中医药还能延缓癌症进展的速度、缓解患者的临床症状，从而提高患者5年生存率，如今在胃癌和肝癌治疗中的应用也越来越广泛[7]。

中医理论认为胃癌的形成是在素体脾胃虚寒的基础上，饮食生冷，感受湿热寒邪，日久郁积引起的气血运行不畅[8]，最常见的证型为脾气虚证、肝胃不和证、痰湿证、热毒证、血虚证、血瘀证等[9]。胃癌的治疗原则一般以益气健脾、活血化瘀、清热解毒为主[10]。肝癌的病机以正气不足、痰瘀毒等邪气内盛为主，治疗以扶正祛邪为法[11]。荔枝核为无患子科、亚热带常绿乔木荔枝的干燥成熟种子，性温，味甘、微苦，归肝、肾经，具有行气散结、祛寒止痛的作用[12]。现代药理学研究表明，荔枝核提取物的化学成分可通过影响细胞增殖、凋亡、自噬、转移、血管生成、免疫靶向，以及提高化疗和放疗敏感性等，从而发挥抗癌作用[13]。基于中医理论的辨证论治，胃癌和肝癌的证型均以痰、瘀、毒为主，治疗方案以活血化瘀、化痰散结、解毒等为主，而荔枝核恰可用于行气散结。因此，本研究基于网络药理学方法，探究荔枝核异病同治胃癌和肝癌的可能性，为荔枝核的临床应用提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 荔枝核有效化学成分及其作用靶点的筛选 登录中药系统药理学数据库与分析平台(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，以“荔枝核”为关键词，设置筛选标准为口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和药物相似性(drug likeness,DL)≥0.18，检索荔枝核的有效化学成分。再利用中药系统药理学数据库与分析平台检索有效化学成分对应的作用靶点。最后在UniProt 数据库(https://www.uniprot.org/)中，将限定物种设置为人类，将所有靶点名称转换为标准基因名。

1.2 荔枝核治疗胃癌和肝癌的共同靶点获取 以“gastric cancer”和“liver cancer” 为关键词，在GeneCards®数据库(https://www.genecards.org/)和OMIM®数据库(https://www.omim.org/)中检索胃癌和肝癌相关靶点，然后设置“Relevancescore≥15”进行筛选；将最终筛选得到的靶点导入 Excel 表格中进行标准化处理，包括删除重复靶点等。使用微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)将荔枝核有效化学成分的作用靶点与胃癌和肝癌相关靶点取交集，即为荔枝核治疗胃癌和肝癌的共同靶点，利用UniProt 数据库(https://www.uniprot.org/)将共同靶点名称转换为标准基因名。

1.3 “中药-成分-靶点”网络和“中药-共同靶点-疾病”网络的构建 将筛选得到的荔枝核有效化学成分及其作用靶点信息导入 CytoScape 3.7.2软件构建荔枝核“中药-成分-靶点”网络图。再将共同靶点信息导入CytoScape 3.7.2 软件绘制荔枝核治疗胃癌和肝癌的“中药-共同靶点-疾病”网络。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建 将荔枝核治疗胃癌和肝癌的共同靶点导入STRING平台(https://string-db.org/，version 11.0)，限定物种设置为人类，并设置互相作用平分相关度≥0.40，隐藏游离节点，不另外扩充互动靶点，利用CytoScape 3.7.2软件制作蛋白质-蛋白质互相作用(protein-protein interaction,PPI)网络图。在CytoScape 3.7.2软件中点击CytoHubba并选择degree(即度值)，筛选排名前20的核心靶点，并采用相同的方法重新构建核心靶点的PPI网络。

1.5 共同靶点的功能富集和通路富集分析 将共同靶点上传至 Metascape平台(http://metascape.org/)，限定物种设置为人类，进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。设定P<0.01为筛选条件，再根据-LgP值对富集分析结果进行由大到小排序，选取排名前10的条目，再利用微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)进行可视化处理。

2 结 果

2.1 荔枝核的有效化学成分及其作用靶点 共获得荔枝核有效化学成分8个(见表1)，以及有效化学成分对应的作用靶点179个。通过CytoScape 3.7.2软件构建“中药-成分-靶点”网络，该网络由188个节点、222条边组成，见图1。

表1 荔枝核有效化学成分的基本信息

图1 “中药-成分-靶点”网络

2.2 荔枝核治疗胃癌和肝癌的共同靶点 分别得到胃癌和肝癌相关靶点1 177个、1 281个；将两者与荔枝核有效化学成分的作用靶点取交集，得到共同靶点61个，即为荔枝核治疗肝癌和胃癌的共同靶点(见图2)。通过 CytoScape 3.7.2 软件绘制“中药-共同靶点-疾病”网络，见图3。

图2 荔枝核有效化学成分的作用靶点与胃癌和肝癌相关靶点的韦恩图

图3 “中药-共同靶点-疾病”网络

2.3 共同靶点的PPI网络 荔枝核治疗胃癌和肝癌的共同靶点的PPI网络由58个节点、699条边组成，节点平均度值为23.3，节点平均介数中心性为0.696，见图4。根据网络节点的度值筛选出核心靶点20个，构建核心靶点的PPI网络，该网络由20个节点、103条边组成，核心靶点包括 MYC原癌基因(MYC proto-oncogene,MYC)、雌激素受体1(estrogen receptor 1,ESR1)、细胞周期蛋白1(cyclin D1)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、Caspase-3、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)A、缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)1A、Erb-B2受体酪氨酸激酶(Erb-B2 receptor tyrosine kinase,ERBB)2、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)1、Fos原癌基因(Fos proto-oncogene,FOS)、孕酮受体(progesterone receptor，PGR)、Caspase-8、过氧化物酶体增生激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARG)、雄激素受体(androgen receptor，AR)、MAPK8、B细胞κ轻肽基因增强子核因子抑制因子(nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor alpha，NFKBIA)、网状内皮细胞过多症病毒癌基因同源物A(reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A，RELA)、Caspase-9，见图5。

图4 荔枝核治疗胃癌和肝癌的共同靶点的PPI网络

图5 荔枝核治疗胃癌和肝癌的核心靶点的PPI网络

2.4 GO功能富集分析结果 61个共同靶点共涉及3 588个生物过程，442个分子功能，以及281个细胞组分，各选取-LgP值排名前10的条目进行可视化分析，见表2。涉及的生物过程主要有凋亡信号通路、对无机物质的反应、细胞死亡正调控、上皮细胞增殖等；涉及的细胞组分主要有膜筏、囊泡腔、受体复合物等；涉及的分子功能主要有激酶结合、DNA结合转录因子结合、蛋白激酶活性等。见图6。

图6 GO功能富集分析柱状图

表2 GO功能富集分析结果

2.5 KEGG通路富集分析结果 61个共同靶点共富集 333 条信号通路(均P<0.01)，根据-LgP值大小筛选排名前10的主要通路，见表3及图7。

表3 KEGG通路富集分析结果

图7 KEGG通路富集分析气泡图

3 讨 论

本文采用网络药理学对荔枝核异病同治胃癌和肝癌的有效化学成分及其作用机制进行研究，筛选出荔枝核有效化学成分8个，包括表儿茶素、槲皮素、豆甾醇、甘露醇、β-谷甾醇、谷甾醇、油酸乙酯、油酸丁酯。其中槲皮素是一种天然的黄酮类化合物，体内和体外实验均表明槲皮素可通过介导多个信号通路抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制血管生成、改变细胞周期、影响自噬等，具有抗肿瘤作用，涉及的信号通路包括磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、Wnt/β-catenin、MAPK/细胞外信号调节激酶1/2等[14-15]。此外，其余几种有效化学成分也被证明具有预防癌症的作用[16-17]。

本研究结果显示，荔枝核治疗胃癌、肝癌的共同靶点有61个，进一步筛选获得核心靶点20个，即MYC、ESR1、cyclin D1、EGFR、Caspase-3、VEGFA、HIF1A、ERBB2、IL-6、PTGS2、MAPK1、FOS、PGR、Caspase-8、PPARG、AR、MAPK8、NFKBIA、RELA、Caspase-9。研究显示，ESR阳性的胃癌患者，其3年生存率高于ESR阴性患者，提示ESR可能抑制胃癌的侵袭[18]。MYC可通过调控关键细胞的基因功能，如DNA代谢动力学，细胞周期、凋亡、黏附、存活，以及蛋白质和大分子合成，在肿瘤的进展中发挥重要作用[19]。MYC的活化可促进肿瘤的发生，上调MYC能够促进胃癌患者的局部或远处转移[20]。EGFR属于酪氨酸激酶受体ERBB家族成员，EGFR信号级联是细胞增殖、分化、分裂、存活和癌症发展的关键调控因素[21]。有研究表明,EGFR通过激活MAPK信号通路、信号转导子和转录激活因子5、Ras-Raf-MEK信号通路，来促进胃癌恶化[22]。细胞周期蛋白是同源细胞周期依赖性激酶的变构激活剂，它们的水平通常在细胞周期中呈波动状态，当cyclin D1过表达时细胞周期依赖性激酶活性失调，导致在有丝分裂信号受限的条件下细胞快速生长，绕过关键的细胞检查点，最终导致肿瘤生长[23]。研究表明，沉默cyclin D1可抑制肝癌细胞的分化并且能够改善肝癌对5-氟尿嘧啶的耐药性[24]。研究表明，Caspase-3的失调可介导胃癌和肝癌的发生和发展[25-26]。这些研究均提示ESR1、MYC、EGFR、Cyclin D1等靶点与胃癌和肝癌关系密切，而荔枝核可能是通过作用于这些靶点起到治疗胃癌和肝癌的作用。

本研究GO功能富集分析结果显示，荔枝核治疗胃癌和肝癌涉及的生物过程主要有凋亡信号通路、对无机物质的反应、细胞死亡正调控、上皮细胞增殖等；涉及的细胞组分主要有膜筏、囊泡腔、受体复合物等；涉及的分子功能主要有激酶结合、DNA结合转录因子结合、蛋白激酶活性等。细胞凋亡是一种细胞程序，受到基因的精细调控[27]。细胞凋亡异常被认为是癌症的特征之一[28]。细胞凋亡异常不仅与肿瘤的发生和发展有关，而且与肿瘤的耐药性有关[29]。膜筏是细胞膜的分子结构，在维持细胞膜屏障功能和流动性方面起着重要作用。膜筏可通过控制癌细胞的信号转导功能，调控多种生物过程，如生长、增殖、迁移、侵袭或转移[30]。细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由细胞主动释放的纳米囊泡，其在许多生理和病理过程中发挥介导细胞间信息交流的作用[31]。研究显示，与正常细胞相比，癌细胞富集大量EVs，EVs有助于研究肿瘤发生的潜在机制和生物分子基础[32]。本研究KEGG通路富集分析结果显示，荔枝核治疗胃癌和肝癌主要涉及的通路有癌症相关通路、癌症中的蛋白聚糖、VEGF信号通路、HIF-1信号通路等。这些通路可能在荔枝核异病同治胃癌和肝癌中发挥着重要作用。细胞外基质失调可以为肿瘤细胞提供有利的生存条件，从而导致肿瘤的发生和发展。而蛋白聚糖是构成细胞外基质的主要大分子，也是细胞外基质的主要组成部分，在维持组织内环境稳定中起着重要的生理作用。蛋白聚糖通过与细胞外基质中的各种细胞因子、生长因子、细胞表面受体、黏附分子、酶和糖蛋白直接或间接相互作用，影响细胞行为和基质特性，从而在肿瘤的血管生成、增殖、侵袭和转移中发挥着重要作用[33-34]。已有研究表明，蛋白聚糖在胃癌和肝癌的发生、发展过程中发挥着重要作用[35-36]。VEGF在病理条件下通过调节血管生成促进肿瘤的生成[37]。研究表明，通过抑制VEGF通路可起到抑制胃癌发生、发展的作用[38]。另一项研究表明，miR-26b通过PI3K/AKT和核因子κB/MMP-9/VEGF途径抑制人肝癌细胞增殖[39]。此外，还有多项研究证实了VEGF的失调在胃癌和肝癌的发生、发展中发挥着重要作用[40-42]。结合本研究富集分析结果，我们推测荔枝核可能通过干预癌症相关通路、VEGF信号通路等途径发挥治疗胃癌和肝癌的作用。

综上所述，荔枝核主要通过调节凋亡信号通路等生物过程，作用于膜筏、囊泡腔等细胞组分，进而实现激酶结合、DNA结合转录因子结合等分子功能，以及调控癌症相关通路、VEGF信号通路、HIF-1信号通路等，最终起到防治胃癌和肝癌的作用。本文以中医药理论为依据，通过网络药理学分析荔枝核异病同治胃癌和肝癌的可能机制，推断可能成为靶向治疗的潜在靶点，这为胃癌和肝癌的临床诊断和个体化用药提供指导，为后期进一步研究开发荔枝核配伍治疗提供了新思路。