地黄炮制过程中HPLC-RID 指纹图谱及模式识别研究

张丽先，宁二娟，李智宁，魏 悦，李飞飞，张桃桃

（河南省科学院，a.河南省纳普生物技术有限公司；b.天然产物重点实验室，郑州 450002）

地黄为玄参科植物地黄（Rehmanniae radix）的新鲜或干燥块根，秋季釆挖，除去芦头、须根及泥沙，鲜用，习称“鲜地黄”；除鲜用外，进行初步处理和干燥，得另一种鲜地黄形式地黄片，便于储存，以保证中药材质量；将地黄缓缓烘焙至约八成干，习称“生地黄”；生地黄酒炖至酒吸尽，取出，晾晒至外皮黏液稍干时，切厚片或块，干燥，即得熟地黄。鲜地黄清热生津、凉血止血，用于热病伤阴、舌绛烦渴；生地黄清热凉血、养阴生津，用于舌绛烦渴、阴虚内热；熟地黄滋阴补血、益精填髓，用于肝肾阴虚、血虚萎黄［1-5］。

鲜地黄、生地黄、熟地黄药性迥异，主要归因于加工炮制过程中化学成分的变化。糖类成分在地黄中含量很高，其中鲜地黄中水苏糖含量高达60%。研究表明低聚糖类成分有调节肠道菌群、调节血糖和血脂、保肝、抗肿瘤的功效，是一种极佳的功能性食品原料［6］。开展炮制前后地黄中糖类成分变化的研究对于低聚糖产品开发意义重大，为此，本试验建立地黄炮制过程中不同炮制品HPLC-RID 特征图谱分析方法，同时测定地黄中果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖5 种糖类成分含量，以期借助模式识别评估鲜地黄（包括地黄片）-生地黄-熟地黄不同炮制品中糖类成分差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪，ME204万分之一电子天平（梅特勒托利多仪器上海有限公司）；AUW 220D 十万分之一天平（日本岛津公司）；KQ-500E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.1.2 药品与试剂 葡萄糖（批号110833-201506，纯度99.9%）、水苏糖（批号112031-201701，纯度90.5%）购自中国食品药品检定研究院；果糖（批号171202）、蔗糖（批号17042602）、棉子糖（批号1704705），纯度≥98%，购自成都普菲德生物技术有限公司，乙腈为色谱纯（天津四友精细化学品有限公司），水为娃哈哈纯净水。

1.1.3 地黄来源 鲜地黄、生地黄购自河南省各地，熟地黄由实验室依据酒炖法自行炮制。地黄来源见表1。

表1 12 批地黄来源

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX NH2色谱柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-纯水（70∶30，体积比）混合溶液为流动相，流量1.0 mL/min，柱温40 ℃，RID 温度50 ℃。

1.2.2 供试品溶液配制 鲜地黄切成小块，研碎；生地黄、熟地黄切成约5 mm 的小块，经80 ℃减压干燥24 h 后，磨成粗粉。鲜地黄取约2.0 g（地黄片、生地黄、熟地黄取约0.5 g），精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50%乙腈25 mL，称定重量，超声（500 W，40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用50%乙腈补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.3 对照品溶液配制 取适量果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水苏糖对照品，用50%乙腈溶解于5 mL容量瓶中，得1 mg/mL 的混合对照品溶液，混合对照品及单一对照品色谱见图1。

图1 混合对照品及单一对照品HPLC-RID 色谱图

1.2.4 HPLC-RID 特征图谱建立 按照“1.2.2”制备1～12 号供试品溶液，在“1.2.1”色谱条件下进样分析，采集1～12 号样品色谱图作为HPLC-RID 特征图谱，见图2。

图2 12 批样品HPLC-RID 特征图谱

2 结果与分析

2.1 相似度评价结果

在Open Lab 工作站中导出1～12 号样品AIA 格式的数据文件，在中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723 版本）中依次打开，设置1 号样品色谱图为参照图谱，经过多点校正、峰匹配后，计算相似度，相似度结果见表2。12 批地黄不同炮制品指纹图谱相似度大于0.900，说明地黄炮制前后寡糖类成分种类未见显著差异，单独基于相似度分析不能很好地区分地黄不同炮制品。

表2 12 批样品相似度计算结果

2.2 主成分分析

PCA 是一种使用最广泛的数据降维算法，基本思想就是在保留原始变量尽可能多的信息的前提下达到降维的目的，从而简化问题的复杂性并抓住问题的主要矛盾，揭示事物内部变量之间的规律性，简化问题，提高分析效率，得到对事物特征及其发展规律的一些深层次的启发［7］。借助SPSS 16.0 数据分析软件对12 批样品5 个指标性糖类成分峰面积进行主成分分析，PC1 和PC2 两个主成分的累积贡献率分别为59.04%、24.05%，合计为83.09%，能够概括地黄样品的绝大部分信息，分类结果见图3。

图3 12 批地黄不同炮制品PCA（○：生地黄，◇：熟地黄，+：鲜地黄）

2.3 聚类分析

HCA 是一个把数据对象划分成子集的过程，每个子集是一个簇，使得簇中的对象彼此相似，但与其他簇中的对象不相似。聚类的输入是一组未被标记的样本，聚类根据数据自身的距离或相似度划分为若干组，划分的原则是组内距离最小化而组间距离最大化，是一种非监督的算法［8］。运用SPSS 16.0 统计分析软件对12 批样品进行聚类分析，以组间联接法聚类，平方Euclidean 距离为指标，结果见图4。12批地黄炮制品分为3 类，其中生地黄1～4 号聚为一类，熟地黄5～7 号为一类，鲜地黄包括地黄片8～12号聚为一类，聚类结果与PCA 结果一致。表明地黄不同炮制品之间寡糖成分含量差异明显，选定的果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖能较大程度上代表地黄不同炮制品之间寡糖类成分的差异。地黄片与鲜地黄中寡糖类成分无显著差异，可作为鲜地黄难以长期储存的解决办法。

图4 12 批地黄不同炮制品HCA 结果

2.4 含量测定

2.4.1 精密度试验 取“1.2.3”混合对照品溶液，按“1.2.1”色谱条件连续进样6 次，计算6 次测定中果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水苏糖峰面积的RSD，分别为1.52%、1.39%、1.25%、1.74%、0.96%、2.05%，仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取1 号样品，按“1.2.2”方法平行制备供试品溶液6 份，按“1.2.1”色谱条件测定，果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水苏糖峰百分含量的RSD依次为1.63%、2.18%、2.95%、2.68%、2.84%，该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取1 号样品，按“1.2.2”方法平行制备供试品溶液，分别于制备后0、4、8、12、24、48 h，按“1.2.1”色谱条件测定，果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水苏糖峰面积的RSD分别为1.75%、1.69%、2.54%、2.69%、2.87%，供试品溶液在48 h 内稳定。

2.4.4 加样回收率试验 取1 号样品，分别精密称取6 份0.25 g，置于25 mL 量瓶中，分别加入与已知含量等量的5 种对照品，水定容，超声30 min，过膜，上机分析，计算各指标成分的回收率。果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水苏糖平均回收率分别为95.1%、98.6%、95.2%、102.7%、103.6%，RSD分别为2.15%、3.06%、3.45%、2.98%、2.66%，该方法准确可靠。

2.4.5 含量测定 将制备的1～12 号供试品溶液和混合对照品溶液按照“1.2.1”色谱条件依次进样分析，记录5 指标成分色谱峰峰面积，外标法依次计算果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水苏糖含量，具体见表3。

表3 12 批不同地黄炮制品中5 种糖的含量（单位：%，n=3）

3 小结与讨论

试验建立了HPLC-RID 法同时测定地黄不同炮制品中果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖5 种单糖及低聚糖含量的方法，方法可靠，便于操作。考虑到温度、风、废液瓶放置等环境因素对示差检测器的稳定及数据采集影响较大，测试开展之前需检查仪器环境是否适宜；鉴于氨基柱反相使用耐受性差、流动相均一性对示差检测器基线平稳影响大，选择单相70%乙腈为流动相；由于折光率随温度变化很大，温度不恒定，噪音和灵敏度显著受损，示差检测器必须恒温，综合考虑色谱柱耐受性及出峰情况，柱温箱、流通池温度分别设置为40、50 ℃。

果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖5 种糖组分的主成分分析及聚类分析结果一致，表明5 种糖较好地表达了鲜地黄、生地黄、熟地黄之间的差异与联系，其中切片快速冷冻干燥的地黄片与鲜地黄中5种糖类成分无明显差异，可将地黄片作为鲜地黄的一种储存方式，较大程度上缓解鲜地黄难以储藏、容易腐烂变质、发芽等问题。

地黄采摘后，在鲜地黄-生地黄-熟地黄加工炮制过程中，果糖含量逐步递增，水苏糖含量降低，蔗糖、棉子糖含量先升高后降低，葡萄糖含量变化不明显。可能是炮制过程中，由于糖受热不稳定，水苏糖可分解为三糖和二糖，棉子糖可分解为蔗糖、果糖等，而蔗糖又有可能分解为果糖和葡萄糖，从而使得地黄中各种糖含量处在动态变化中。