恩施地区常见乳菇类野生菌分子鉴定及系统发育分析

韩 玉，吴 尧，揭春玉，王 林，吴双清

（恩施土家族苗族自治州农业科学院，湖北 恩施 445000）

乳菇属（Lactarius）为担子菌亚门层菌纲伞菌目红菇科真菌，常与树木如马尾松、松树、云杉等形成外生菌根，大多为食用菌，味道鲜美，具有较高的营养价值和医用价值［1，2］。利用分子生物学技术将乳菇类真菌归为Lactarius、Lactifluus、Multifurca3 个属［2］。

湖北省恩施土家族苗族自治州（以下简称恩施）地处武陵山区，是天然野生菌生长繁殖的理想场所。每年6—10 月，有一种被老百姓称为“枞树菌”的乳菇菌大量生长，该乳菇菌味道鲜美，但因为相似菌株多，农民鉴别能力不强，常造成误采误食。鉴于中毒现象增多及生态环境保护政策，政府大力宣传保护自然生态系统，禁止兜售野生菌，因此，对当地特色资源的调查和开发利用成为迫切需要解决的问题。

当前，恩施地区野生菌种类的相关报道较少。为详细了解当地常见乳菇属野生菌的特性，本研究从分子生物学水平分析恩施地区菌株种类及其遗传多样性。近年来ITS 广泛应用于乳菇菌、羊肚菌、木耳等其他食用菌的遗传多样性检测和分析上［3-6］，本研究亦采用ITS 序列分析法对恩施地区常见乳菇属野生菌进行分析鉴定，以期为当地生态资源保护和筛选优良可食用野生菌提供理论依据，同时促进野生菌驯化栽培进程。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 在生长季节，收集恩施不同地点、不同时期的样品于自封袋内，标记时间、地点后置于装有冰袋的冷藏箱中，带回实验室进行处理和分离培养（表1）。

表1 菌株编号及来源

1.1.2 主要试剂 2×TaqPCR StarMix with Loading Dye，北京康润诚业生物科技有限公司；4S Green Plus 无毒核酸染料，生工（上海）股份有限公司；50×TAE Buffer，提取DNA 试剂均为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器 HH-4 型恒温水浴锅，金坛科兴仪器厂；VoRTEX-5 型振荡仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Centrifuge 5424R 型微量冷冻离心机，德国艾本德公司；Biometra TRIO 48 型PCR 仪，德国耶拿公司；DYY-6D 型电泳仪，北京六一生物科技有限公司；Gel DocXR+型凝胶成像系统，美国伯乐公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 提取 采用CTAB 法。

1.2.2 ITS 区段的扩增及测序 用生工（上海）股份有限公司合成的ITS1 和ITS4 通用引物对目的基因进行PCR 扩增，扩增体系（50 μL）：2×TaqMaster Mix（with Dye）25 μL，DNA 1 μL，10 μmol/L ITS1 2 μL，

10 μmol/L ITS4 2 μL，ddH2O 20 μL。反 应 程 序：94 ℃预变性，94 ℃变性1 min；55 ℃退火40 s；72 ℃延伸1 min 30 s，循环35次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取3 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 测序分析 将PCR 产物送至生工（上海）股份有限公司进行正向测序。测得序列在GenBank 核酸数据库中进行BLAST 比对，根据相似性由高到低进行排列选取最近同源物。借助MEGA 5.0 软件将所有需要比对的序列采用邻接法构建系统发育树并进行遗传距离分析。外类群有红菇属（Russula vinosa）（AF418638.1）和 乳 菇 属（Lactarius vividus）（KT163432.1）2 种。

2 结果与分析

2.1 PCR 扩增及电泳检测结果

PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测，均能得到目的条带，条带清晰，片段长度约750 bp（图1）。

图1 菌株PCR 电泳结果

2.2 ITS 序列比对分析

根据比对结果，发现24 份菌株样品中有17 份与Lactarius vividus相似；3 份与Lactarius salmonicolor相似；3 份与Lactarius hatsudake相似；1 份与Lactifluus pilosus相似，相似性均达99%～100%（表2）。

表2 菌株ITS 序列BLAST 比对结果

2.3 系统发育树分析

由图2 可知，S1、S2、S3、S4、S5、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16、S22 和S23 与Lactarius vividus聚为一支（支持率为100%），S15 和S23 又分别形成一个小分支，说明这些菌株在系统发育学分类上为鲜艳乳菇；由图3 可知，菌株S6、S17 和S21 与Lactarius salmonicolor聚为一支，支持率为65%，说明它们可能存在地理隔离，导致菌株间可信度不高；由图4 可知，菌株S18、S19 和S20 与Lactarius hatsudak、Lactarius akahatsu（MN258654.1）和Lactarius deterrimus（MZ158281.1）聚为一支（支持率为59%），但S18、Lactarius akahatsu和Lactarius deterrimus都存在较长的分支，说明菌株S18、S19 和S20 可能都为红汁乳菇，但是其亲缘关系较比对的样品更远，是否与地理隔离有关，仍需大量的试验数据证明；由图5 可知，菌株S24 与Lactifluus pilosus聚为一支，支持率为97%，证明S24 为长绒多汁乳菇。

图2 S1、S2、S3 等系统进化树

图3 S6、S17 和S21 系统进化树

图4 S18、S19 和S20 系统进化树

图5 S24 系统进化树

2.4 部分样品遗传距离分析

为了进一步鉴定所测菌株的特性，对采集的样akahatsu、Lactarius deterrimus遗传距离相对较远；S24 与聚为一支的Lactifluus pilosus（MZ157882.1）遗传距离为0。品与其聚为一支的菌株进行遗传距离分析（表3），发 现S1、S2、S3、S4、S5、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S16 和S22 与3 个最近的Lactarius vividus遗传距离为0，而S15 和S23 与同源物存在一定的遗传距 离；S6、S17 和S21 均 与Lactarius salmonicolor（JX852629.1）遗传距离为0；S19 和S20 与Lactarius hatsudake遗传距离为0，而S18 与Lactarius hatsudake存在一定的遗传距离，S18、S19 和S20 均与Lactarius

表3 遗传距离

综合以上结果可知，S1、S2、S3、S4、S5、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16、S22 和S23 为鲜艳乳菇；S6、S17 和S21 为鲑色乳菇；S18、S19 和S20为红汁乳菇；S24 为长绒多汁乳菇。部分样品在系统发育分析中与最近同源物之间存在一定的差异，可能是因为地理隔离造成的。

3 小结与讨论

24 份恩施地区常见的乳菇类菌株资源样品均采用ITS 序列分析法和GenBank 数据库比对进行鉴定，结果表明，有17 份样品为鲜艳乳菇、3 份为鲑色乳菇、3 份为为红汁乳菇，1 份为长绒多汁乳菇，与相关形态学描述相同［7，8］。说明恩施地区常见的野生食用菌主要以鲜艳乳菇为主，还有少量的鲑色乳菇和红汁乳菇，但各菌株之间存在一定的差异，可能与地理隔离有关。在野生食用菌的生长采摘期，存在一些有毒菌，最易混淆的就是本试验采集鉴定的长绒多汁乳菇，其属于水乳菇属（Lactifluus），食用后可导致胃肠中毒［9，10］。有关长绒多汁乳菇的报道较少，恩施更是首次报道。恩施地区野生菌种类繁多，在当地被称为“枞树菌”的野生菌实则包含多个品种，同时部分有毒野生菌形态特征与其非常相近，人们不易辨别，每年都有多起中毒事故发生。本研究收集的样品有限，是否有未收集到的资源有待进一步取样鉴定。下一步将增加取样点，获得更深入的研究数据，以期利用当地特色资源，对适合当地生长的野生食用菌进行驯化和改良，发展食用菌产业，满足人们对特殊食用菌的需求，为乡村产业振兴贡献力量。