推拿手法对缺血再灌注大鼠脑神经及自噬相关蛋白Beclin 1 表达的影响

蒙 蒙，胡冠宇，娄惠娟，张予心，王宇峰，丛德毓*

（1.长春中医药大学，长春 130117；2.南方医科大学，广州 510630；3.吉林省中医院，长春 130021 ）

脑卒中是全球第二大死亡的主因，也是致残的首要因素，在亚洲国家，脑卒中的发生情况正在逐年增加[1]，属于中枢神经系统急性的脑血流循环障碍性疾病范畴，包括出血性和缺血性两种，缺血性脑卒中是主要发病类型，占发病人群的85%左右，给患者的正常生活带来了极大的挑战与威胁[2]。脑缺血再灌注损伤是由于脑部的出血被阻断，血液再次被灌流到 脑缺血的半暗部，从而进一步加重脑组织损伤程度，导致神经细胞发生损伤和坏死[3]。研究认为，细胞自噬发生在脑缺血再灌注阶段，参与了脑神经组织与细胞的损伤和凋亡过程[4]，因此调节细胞自噬是医治与预防脑缺血再灌注损伤的潜在治疗靶点。现代医学表明，推拿手法有增加局部血流量，促使受损神经细胞恢复的作用。本实验以建立脑缺血再灌注动物模型为前提，以推拿手法作为干预手段，初步探讨推拿手法调节自噬蛋白Beclin 1 的表达来影响脑卒中的治疗，为临床治疗提供了丰富的科研数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级成年雄性Sprague-Dawley 大鼠共30 只，6～8 周龄，体质量（220±20）g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司供货[SCXK（吉）-2018-0007]。动物购回后，进食和摄水不受限制。持续性饲养1 周后造模。

1.2 造模方法 建立能模拟人的缺血性卒中再灌注大鼠（MCAO/R）模型[5]，适应性喂养1 周后，禁食不禁水12 h。在手术后1 d，采用Zealonga[6]评分的方法来筛选，得分在1～3 分后纳入。

1.3 动物分组及干预

1.3.1 动物分组 按顺序随机抽取大鼠20 只，建立MCAO/R 模型。造模后平均随机分为模型组和推拿组，推拿治疗组为进行手法刺激，其他2 组仅作为观察不做处理。

1.3.2 推拿手法治疗 在造模成功后进行手法刺激，根据华兴邦等编著的《实验动物腧穴图谱》来确定推拿组大鼠进行穴位操作的准确位置，选择头顶部百会、神庭，腿部足三里，点按法操作每次10 min，每日1 次。于每日上午9 点进行推拿手法刺激，连续治疗，14 d后动物处死、取样本。

1.4 观察指标与检测方法

1.4.1 行为学检测 在造模1 d、3 d、7 d、14 d 后以ZeaLonga 评分法对大鼠神经功能进行评估。

1.4.2 TTC 测量 推拿后14 d，每组大鼠腹腔注射过量麻药后，将脑组织快速取出，暂时冷冻后，连续5 次切成2 mm 后的脑片，TTC 染色后拍照，用Image J 图像分析软件来测量各组脑组织梗死体积占比分布情况。

1.4.3 TUNEL 染色 再灌注后14 d，取患侧脑组织，根据TUNEL 染色试剂盒说明书加入染料，利用激光共聚焦显微镜拍取图像，检测脑神经凋亡的情况。

1.4.4 Western Blot、qPCR 检测各组大鼠脑皮质的Beclin 1、Beclin 1mRNA 的表达情况 再灌注后14 d，冰下取鼠脑组织，冻于-80℃中，用以检测Becliln 1 的蛋白及mRNA 含量。

1.5 统计学方法 数据分析应用SPSS 20.0进行统计，用均数±标准差（）表示计量资料，单因素方差分析用于2 组间的比较，治疗前后的比较用t检验分析。

2 结果

2.1 各组间神经功能评分比较 见表1。推拿法治疗可以有效改善病鼠脑卒中后的神经功能状况。

表1 各组间神经功能评分比较（，n =10）

表1 各组间神经功能评分比较（，n =10）

注：与假手术组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

2.2 各组大鼠脑梗死情况评价 见表2，图1 所示。图中红色部分显示正常脑组织，苍白的部位则为梗死区域；肉眼观察假手术组没有明显梗死区域；模型组则有较大范围的缺血性梗死灶，较模型组梗死灶体积来说，推拿组的梗死灶体积有明显的减少。

表2 各组间脑梗死面积比较（）

表2 各组间脑梗死面积比较（）

注：与假手术组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

图1 各组大鼠TTC 染色结果

2.3 TUNEL 法检测神经细胞凋亡 在光学显微镜下来观测各组大鼠脑组织的凋亡情况。如图2 所示，治疗14 d 后，存在大量凋亡细胞的为模型组，几乎没有阳性凋亡细胞的为假手术组，细胞凋亡数目明显增多的为模型组；治疗组的凋亡细胞较模型组有所降低。

图2 各组大鼠TUNEL 染色结果

2.4 推拿治疗对MCAO/R 大鼠脑组织中Beclin 1 蛋白表达的影响 见表3，图3。结果显示，治疗14 d 后，推拿组的蛋白表达比另2 组有明显升高。

表3 各组间Beclin 1 蛋白水平比较（，n =3）

表3 各组间Beclin 1 蛋白水平比较（，n =3）

注：与假手术组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

图3 各组大鼠Beclin 1 蛋白水平比较

2.5 推拿治疗对MCAO/R 大鼠脑组织中Beclin 1 mRNA 表达的影响 如表4。结果显示，治疗14 d 后，推拿组大鼠脑皮质Beclin 1 mRNA表达较模型组增加。

表4 各组间Beclin 1mRNA 比较（，n =6）

表4 各组间Beclin 1mRNA 比较（，n =6）

注：与模型组比较，△△ P ＜0.01

3 讨论

脑卒中在中医学中归属于“中风病”范畴，在《内经》中有较为详尽的记载，古代医家认为其病因病机可分为：“外风”“内风致病”“内伤外感同时致病”等理论，现代中医认为中风是多因素综合作用的结果，其发生多与所处的内外环境具有紧密的关系。但从总体上看，它属于本虚标实。文献记载，“阳脉之海”“病变于脑，首选督脉”，以往有学者也证实百会能减少脑梗死的体积和加强神经功能的评分，并在缺血性中风中发挥潜在的神经保护的治疗作用[7]，并在治疗神经系统疾病上发挥了重要的作用[8]，同时神庭与百会相配，可以起到促进睡眠的作用，从而帮助脑神经递质的修复[9]。足三里可以起到增强体质的作用，同时运用点按法作用于各穴位，可加强气血的运行，进一步加强身体的修复能力。因此本实验基于“形神并重”的治疗理念，采用“治神调形”的中医治疗原则，择百会作为主穴，同时配伍神庭、足三里[10]。通过推拿按揉头部百会、神庭，腿部足三里，达到行气活血，通调经脉，补虚泻实，阴阳协调的作用，从而加快中风的康复。有研究[11]证明，百会和足三里配合以JAK2/STAT3 为通路来对脑缺血的大鼠发挥神经保护的作用。

Beclin 1 是atg6 的哺乳动物同源物。Beclin 1 的翻译后调控被干扰可能是调控自噬程度的一种途径[12]。Beclin 1 不仅是调节自噬的关键因子，也可增强PI3K的活性。影响它的表达程度，对治疗脑缺血的各种疾病有着重要的意义[13-16]。推拿手法在脑卒中的恢复过程中发挥了不可替代的作用，相对比康复技术来说，推拿手法的操作更简便，不受时间和地点等条件限定。经过本实验的研究表明脑缺血大鼠的神经损伤及梗死灶是可以通过及时进行推拿手法的干预来改善，根据蛋白检测和荧光染色的结果发现推拿手法可以明显增加大鼠脑内Beclin 1 蛋白及mRNA 含量的表达，从细胞自噬的角度说明了推拿手法可以增加自噬的表达，起到保护脑神经和预防脑卒中的作用，为临床治疗提供新的实验数据支持，为进一步探索推拿手法通过各种通路影响自噬因子的表达奠定了基础。

综上所述，推拿手法可以调节Beclin 1 蛋白及mRNA 含量的表达，并改善脑细胞凋亡情况，从而起到对缺血性脑卒中的治疗作用。