有机污染物对水体真细菌群落结构影响分析

梁 楷

（中国葛洲坝集团水务运营有限公司，湖北 武汉 430000）

引言

由于经济环境的不断扩张，促使人类不断扩大了活动范围，在生产建设过程当中产生的副产品不断被排放到自然环境当中，从而促使微生物的群落结构受到影响，尤其是针对于农业生产中所涉及到的化肥农药以及众多具有较强污染的物质，在排放到生态系统后，将会对微生物群落结构造成严重的影响。基于tRFLP技术的应用，能够清晰地分解水体环境当中的微生物群落结构状态，对比克隆文库序列，从而全面呈现出在有机污染物排放下的水体真细菌群落结构[1-2]。

1 实验研究

1.1 材料准备

由于需要对水体环境进行采样研究，因此需要做好充足的实验准备，将各项需要使用到的试剂以及仪器等准备到位，除了需要对水体环境中的水质结构进行分析，也需要对水体环境中的底泥进行研究，从而才能够全面分析出水体环境中的微生物群落结构。因此，需要准备底泥DNA 的提取试剂盒，并应用到聚合酶载体盒、PCR 引物以及胶回收柱式产物回收试剂盒，准备内切酶MPI、Hhal 以及Rsal。并准备电泳系统、紫外分光光度仪、离子色谱、测序仪测序仪337 分析软件、Sequencher5.0、Phylip3.65[3-4]。

1.2 样本采集水质分析

样本采集时间为秋季11 月上旬，选择水体环境相对稳定的河流，经过检测，当日水体温度为5 ℃，并在整条河流的上中下游各选择不同的点位实施检测，并在日常投放污染物最严重的点位再次设点进行样本采集。分别设定A、B、C、D 4 个点，其中，A 点代表生活污水相对严重的排放河段，B 点则为河流的田间流经河段，C 点则为河流的直流中间段，D 点表示的是河流的下游主干段。在这条河流的4 个不同的点位分别收集水下20 cm 处的水体样本、沉积物样本以及深层底泥样本，各个不同的采样点位平行收集3 份，共计收集12 份样本，并将其粘贴对应标签，在冰盒中进行保存，避免对其生物菌落结构造成破坏，并需要保障能够在采集样本完成后的当日环境当中实施必要的水质参数测量以及样品的DNA 获取。对于各项不同的样本实施检测的过程当中，主要是对水体环境当中具有较高有机污染物含量的水质参数指标进行检测，进一步对水质环境中的化学需氧量以及总磷、总氮等进行检测[1]。分别应用到COD 技术以及TP、离子色谱法进行检测。

1.3 提取DNA

应用到离心机对水质样本当中的100g 水样进行离心沉淀，进而收集其产生的沉淀物，或是对采集的底泥样本进行取样，其中应用到土壤DNA 提取试剂盒对0.25 mg 的污泥实施检测，提取其中的DNA 进行分析，并在pH 值为8 的HCl 溶液中进行溶解。在实施构建DNA 文库的过程当中，需要保障能够应用到相对tRFLP 技术进行集中分析，并基于16SrDNA 保守引物的基础上获取水质样本当中的DNA 结构分布，且在分析过程当中同样需要在引物的8F 端以及6F 端做好相应的标记。形成的PRC 反应程序为40 s下的94 ℃、40 s 下的53 ℃以及60 s 下的72 ℃，并基于这样的反应程序形成30 组循环效果。针对于在tRFLP 技术分析下获得的PCR 产物，需要应用到回收试剂盒进行纯化，应用到的试剂盒种类分为胶回收以及柱式盒。并最终对PCR 产物应用到HCl 溶液进行洗脱。

1.4 tRFLP 技术分析

在MD19 载体当中连接纯化完成的PCR 产物，并应用到氨苄对其阳性克隆效果进行筛查，其中每一个对应的样本都需要应用到100 个阳性克隆实施测序效果，基于Sequencher 5.0 所实施的测序结果并对其中的污染载体实施清除，并下载对应真细菌的不同序列。纯化PCR 产物需要应用到内切酶进行消化，对消化完成的样本取样，其中添加相应的ROX100 上样缓冲液，在经过95 ℃的性质转变之后实施上样处理，并在基因测序仪当中收集3.5 h 的3 kV 片段。使用4.5%的聚丙烯酰胺凝胶以及缓冲液实施冲洗，应用到GenScan3.1 对其进行分析，应用到内切酶软件模拟文库序列结构，将GenScan 分析结果以及序列长度实施对比，进而寻找到相应的TRF 细菌种属。

2 实验结果

2.1 样本水质结果

对淡水环境中的有机污染物的总体程度进行研究需要借助于总磷、总氮以及COD 的相关指标，基于我国出台的关于地表水环境的质量检测报告，集中供水应用的水体环境当中的相关指标需要能够处于相对良好的COD 含量以及总磷含量状态，二者需要小于20 mg/L 以及0.1 mg/L，并且总氮的质量浓度为不能够超过20.65 mg/L[2]。这样的参数标准结合本文当中的实验数据进行研究发现，其中的点A、点B 处水体环境当中的总磷、总氮以及COD 的实际含量超过标准，呈现出明显的水质不合格现象。尤其是在生活污水排放相对较为集中的A 点中，其水质环境呈现出明显的黑色状颗粒物质，并且在检测过程当中飘散出明显的H2S 气味，且周围的植物呈现出相对较为茂盛的生长状态。

而B 点当中的水质虽并无明显的气味，但是仍处于相对浑浊的状态，在河道周围附近生长香蒲与芦苇。这两个不同的点位当中均含有大量的生活污水，这些未经过处理的生活污水当中存在着相对较多的有机物。且由于点A 处的河道其中的水流将会流经B段后进入到支流C 当中，因此在这一过程当中促使水体环境当中的有机物质经过沉降并稀释后，有效降低了水体环境当中的总磷含量、总氮含量以及COD 含量。经过测算，其实际的含量参数能够达到最低标准状态。且对C 点位实施检测的过程中发现，其水质较为清澈，且以灰白色泥沙为主。同样的D 点作为在城市水源当中的关键性水体环境，经过检测，能够达到饮水的基本供给需求。

2.2 水体底泥中微生物群落组成

经过实施水质环境样本检测以及底泥微生物的检测，其中的DNA 呈现出无色透明状态，且产出率能够达到50 μg 左右，其中的OD 系数为1.6，且浓度高达659 μg/L，整体片段约为23并无明显的降解效果，DNA 污染程度相对较差。通过全面检测并克隆测序，底泥样本的AS3 以及DS3 在完成拼接后呈现出77 条与73 条序列状态，经过GenScan 的相似性检测，其中＞97%的序列建立形成相同的操作单元结构，并在其中发现了基于OTU 的存在，并且在D 段当中的水体环境当中对底泥进行检测，其中Proteobacteria 占比能够达到21.9%，β Proteobadteria 的实际占比为10.96%，Bacteroidetes 实际含量为19.8%，Deinococcus Thermus的含量占比为17.18%。相对来讲，这些结构在A 段的水体环境当中的占比相对较为集中，Proteobacteria 的实际占比能够达到47%左右。

2.3 tRFLP 技术下的微生物结构相似性

在对该河段实施检测的过程当中发现，基于4 个不同点位的共计12 个不同的样本当中测试获得的图谱呈现出明显的多样性结构状态，基于50 条带的平均分布结果，形成数字化的泳道条带，基于一致的迁移标准下，存在则无论数值多少记为1，无则记为0[3]。而最终的分析结果证明，在多个水体环境当中的真细菌生物群落以及污泥当中的真细菌生物群落呈现出相对较为独特的效果，基于严重污染状态下A 点以及B 点结构中的实际生物群落状态与C 点以及D 点之间呈现出分割的污染群落结构，进而相应的形成了基于独立存在的微生物群体结构。应用到完整的限制性内切酶对A 及D 点样本形成的文库序列实施模拟酶切后，形成的序列长度对比GenScan 下的条带长度，进而获取到相应的生物结构状态，进过对比能够完全与文库中的相关数据结果相吻合。

3 实验结论

3.1 水体污染降低细菌多样性，富集特殊微生物群落

结合实验分析完成后所获得的水样物质结果发现，其中的取样点A 处存在着明显的有机物污染状况，而对比发现，D 点的水质条件相对较好，对比不同的理化指标以及群落组织结构，其中水体环境下的底泥由于受到人为影响的程度相对较小，因此所形成的真细菌群落结构的多样性较为丰富，能够形成相对宽泛的生态位，并形成更加稳定的生态系统结构。而排污沟附近的底泥环境中，由于受到COD 的影响作用，因此其中的微生物群落接受呈现出特定的微生物富集状况，基于单一化的结构状态，难以构成相对较为稳定的微生物生态系统，如若遇到外界环境变化较大时，则会促使整体的生态系统处于崩溃状态。

因此在生态学当中阐述，关于生态位进行交叉时则能够相应地产生明显的种群优势效果，则会通过改变生物类群的数量进行弥补，才能够保障始终处于稳定的生态系统构造当中，避免外部干扰侵袭。而在水体环境当中，所形成的污染物程度越高则相应地会降低生物多样性。正如在水体环境当中防治的废水处理器，在启动时会产生相对较多的生物结构群落，但是随着使用过程，形成单一的生物驯化状态，进而促使微生物多样性受损，关于废水处理的微生物类群将会呈现出富集状态。因此，在治理水污染环境时，需要尽可能避免排放大量高浓度污染物。这是由于，在污染水体环境当中已然造成相对较为富集的水体环境状态，如若大量排水，则会促使其中的微生物富集群落逐渐流失，从而影响到生态结构。并且由于水体环境已经遭受污染，可以尝试对降解污染物的微生物实施富集处理，进而完全形成降解污染物的效果后，基于底物的存在，机会重新建立真细菌群落结构。

3.2 微生物群落取决于水质，并由外界因素决定分布

由于在本次实验过程当中采集到的水样以及底泥等呈现出相对较为明显的结构相似性，因此将A、B点设定为一组对比观察数据，而C、D 组则同样设定为对比观察数据，这样的真细菌群落结构的相似性模拟实验主要是基于在同一水体环境所产生的[4]。因此，经过对两组不同的水质环境进行实验比较，获得的显著差异性成果其中表明了关于样本当中的COD明显差别状态，同时总氮以及总磷的实际含量差别相对较小。因此则在一定程度上证明了基于微生物群落结构的相似性，极大程度上取决于水质环境的相似性。则可以通过这样的对比实验结果证明，在相似的水质环境当中可以对其中含有的微生物群落结构进行对比推断。

但是需要注意的是，在水质环境当中的COD 等相关参数等，无法基于瞬时变化影响到生物种群的结构状态，因此需要应用到分子生物学对真细菌群落结构进行分析。并且由于在实际当中的水体环境以及沉积物处于差异化的生态介质状态当中，主要是能够形成差异化的微生物群类效果，基于在实验当中的水体环境以及底泥环境当中的微生物种类进行分析，进一步证明了水体与底泥将会形成不同的真细菌生物群落结构。

4 结语

基于近年来在水资源紧缺环境下的应用，造成的水体污染十分严重，而对这样的现象实施有效地解决处理，则需要进一步建立在全面分析水体环境当中的真细菌群落结构的基础上，本文通过实验证明，在处理水体环境当中的有机污染物时需要尽可能地降低对原有的生态环境所造成的破坏，对特殊微生物群落进行富集，从而降解污染物，达到净化水体的作用。