海星皂苷CN-3激活NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路诱导胶质瘤细胞焦亡的作用

杜洋 邱鹏程 王媛媛 郑淑娴 孙光强 陆云阳 薛玉叶 汤海峰

神经胶质细胞瘤多发生于神经外胚层细胞，是常见的颅腔内肿瘤之一，约占中枢神经系统肿瘤的26.7%，其发病率约为5～8/10万，术后中位生存期不足15个月[1-2]。发病率高、复发率高、致残率高、死亡率高及治愈率低是胶质瘤的显著特征。目前，针对胶质瘤的手术结合放化疗的综合治疗手段难以避免胶质瘤弥漫浸润性和治疗抗性的发生[3-4]。因此，寻找新的治疗胶质瘤的化疗药物具有十分重要的意义[5]。

天然化合物及其衍生物由于具有结构多样性特点，在新药发现领域发挥着不可替代的作用[6]。海星(starfish)是一种无脊椎海洋动物，属棘皮动物门海星纲，《本草纲目》《中华海洋本草》均有海星入药治病的记载。中医认为海星具有软坚散结、清热解毒的功效，主治甲状腺肿大，淋巴结核，瘿瘤，瘰疬等症[7-8]。皂苷是海星最主要也是最重要的次生代谢产物，被称为海星皂苷(asterosaponin)，具有丰富的结构多样性，并已被证实具有抗肿瘤、抗菌、抗溃疡、神经保护、溶血等多种药理活性，引起了人们的广泛关注和研究。鉴于许多天然来源的皂苷类化合物具有抗胶质瘤的功效[9]，课题组对中国南海海域的面包海星(Culcitanovaeguineae)开展了化学研究，从中分离鉴定了一个具有新颖结构的海星皂苷面包海星3(Culcitanovaeguineae-3，CN-3)(图1)，发现其显著抑制胶质瘤细胞增殖，并已证实CN-3通过活性氧(reactive oxygen species，ROS)介导的磷脂酰肌醇三激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/ protein kinase B，PI3K/Akt) 通路诱导神经胶质瘤细胞线粒体凋亡[10]，通过下调CUB域EGF样信号肽3(signal peptide, CUB domain and EGF like domain containing 3，SCUBE3)导致神经胶质瘤细胞G1/S期阻滞[11]。

图1 CN-3的化学结构

细胞焦亡(pyroptosis)是一种细胞炎性程序性死亡方式，以质膜快速破裂、随后释放细胞内容物和炎性物质为特征[12]。在焦亡的经典途径中，炎症小体NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)募集并结合凋亡相关微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)，导致ASC聚焦，募集剪切型胱天蛋白酶-1(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Cleaved Caspase-1)并激活Caspase-1。Caspase-1参与白细胞介素-18/1β(interleukin-18/interleukin-1β，IL-18/IL-1β)的切割和成熟以及剪切型gasdermin D蛋白N端(Cleaved N-terminal-gasdermin D， Cleaved N-terminal-GSDMD)的切割。Cleaved N-terminal-GSDMD释放并在质膜中形成孔，导致IL-18/1β的分泌和外液流入，致使细胞肿胀和渗透性裂解，进而引起细胞死亡[13-14]。有研究表明，药物或化合物可诱导肿瘤细胞焦亡[12]，焦亡引发炎症级联反应，导致肿瘤细胞损伤。皂苷诱导肿瘤细胞焦亡的报道较少，如重楼皂苷VI诱导非小细胞肺癌焦亡[15]，以及重楼皂苷H诱导耐替莫唑胺胶质瘤SHG44R细胞凋亡和焦亡的作用研究[16]。细胞焦亡参与了肿瘤的免疫调节，影响肿瘤进展和治疗，深入了解细胞焦亡的机制将有助于发现肿瘤治疗的新策略[17]。作为海洋来源的海星皂苷，CN-3是否可诱导胶质瘤细胞焦亡，尚不知晓。课题组研究发现在低剂量CN-3处理细胞后，胶质瘤细胞膜呈凸起样改变，呈现出焦亡的特征。这种现象在海洋来源皂苷抑制胶质瘤细胞的研究中未见报道，故本文通过研究CN-3诱导胶质瘤细胞焦亡对其抗胶质瘤机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

人神经胶质细胞瘤细胞(U251，编号：1101HUM-PUMC000058)购自国家生物医学实验细胞资源库；脑髓母细胞瘤细胞(LN-229，编号：CL-0578)购自中国武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 仪器

超净工作台(美国Thermo公司，型号：HeraguardTMECO )，CO2恒温培养箱(ESCO公司，型号：CLM-170B-8-NF)，倒置显微镜(天津微仪光学仪器有限公司，型号：WYS-37XB)，血球计数板(上海市求精生化试剂仪器有限公司，型号：XB.K.52)，全自动酶标分析仪(杭州奥盛仪器有限公司，型号：AMR-100)，流式细胞仪(美国BD公司，型号：FACSCalibur)，透射电子显微镜(JEOL，型号：JEM-1400)，电泳系统(美国 Bio-Rad 公司,型号：Mini-PROTEAN®)，凝胶成像系统(美国 Bio-Rad 公司，型号：ChemiDoc XRS+)，微量移液器(BIOHIT公司，Proline)，超纯水系统(Heal公司，型号：NW10LVF)，超速冷冻离心机(HERMLE,型号：Z216 MK)，离心机(湖南赫西仪器有限公司，型号：TDZ4)，数显恒温水浴锅(国华常州仪器制造有限公司，型号：HH-3A)等。

1.3 试药

CN-3[CN-3由实验室自制，从面包海星中分离纯化得到的第3个海星皂苷，简称为CN-3，纯度>99%(HPLC)]，细胞增殖测定(cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒(Elabscience，货号：E-CK-A362)，Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(BD，货号：556547)，DMEM培养基(Gibco，货号：11965092)，胎牛血清(Biological Industries，货号：04-121-1A)，胰蛋白酶(Solarbio，货号：T1300)，青链霉素混合液(Solarbio，货号：P1400)，Caspase-1抗体 (Proteintech，货号：22915-1-AP)、Cleaved Caspase-1抗体(Cell Signaling Technology，货号：D5A72)、CleavedN-terminal-GSDMD抗体(abcam，货号：ab215203)、pro-IL-1β(万类生物，货号：WL02257)、mature-IL-1β抗体(万类生物，货号：WL00891)、IL-18抗体(Proteintech，货号：10663-1-AP)、NLRP3抗体(Proteintech，货号：19771-1-AP)、β-actin 抗体(Proteintech，货号：20536-1-AP)，SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒，封闭液，抗体稀释液，PVDF膜，1×Running Buffer缓冲液粉末(1 L)，1×Transfer Buffer缓冲液粉末(1 L)，全蛋白提取试剂盒，ECL Plus超敏发光液，山羊抗兔IgG抗体。

1.4 细胞培养

U251细胞、LN229细胞培养于含10%胎牛血清、1%青链霉素混合液的DMEM高糖培养基中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中，取对数生长期且状态良好的细胞用于后续实验。

1.5 CCK-8法检测CN-3对胶质瘤细胞的抑制率，判定给药剂量

收集处于对数生长期的U251细胞、LN229细胞，每孔6×103个接种于96孔板，各设6个复孔，同时设置空白组(仅含培养基)，对照组(含有U251细胞或LN229细胞及培养基)及给药组，给药组为细胞及含不同浓度(0.25 μM，0.5 μM，1 μM，2 μM，4 μM，8 μM，16 μM)CN-3药液的培养基。待细胞完全贴壁后，加入含不同浓度CN-3药液的培养基，培养24小时后，弃上清液，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2小时，用酶标仪在450 nm波长测量各孔的吸光度(OD)值，计算细胞抑制率及IC50值。

1.6 透射电子显微镜及倒置显微镜观察细胞膜形态变化

取对数生长期的U251细胞，PBS洗涤，加入3 μM CN-3药液培养24小时后，收集细胞，用2%戊二醛溶液固定2小时，随后PBS洗涤2次，每次 10分钟。然后在1% OsO4溶液中固定2小时。用乙醇梯度脱水后，将细胞包埋在环氧树脂中并切成 50～60 nm 的切片。切片用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色。透射电子显微镜分析切割样品。

取对数生长期的U251细胞，PBS洗涤，配置成浓度为3×104个/mL的细胞悬液，取混匀的100 μL细胞悬液加入96孔板中，设置3个副孔。待贴壁完全、生长状态良好时，分对照组、给药组，对照组加培养基，给药组加含CN-3药液的培养基至3 μM，12小时后在倒置显微镜40倍下观察细胞状态。

1.7 流式细胞术检测细胞焦亡

取对数生长期的LN229细胞和U251细胞，接种于6孔板中，待细胞汇合度达80%左右时，加入CN-3药液至不同浓度(0 μM、3 μM、6 μM)，处理12小时。收集细胞，按照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明进行细胞凋亡双染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率和焦亡率。Annexin V-/PI+表示坏死细胞，Annexin V+/PI+表示焦亡细胞，Annexin V+/PI-表示凋亡细胞，Annexin-V-/PI-表示活细胞[15]。

1.8 Western Blot法检测焦亡相关蛋白表达

取对数生长期的LN229细胞与U251细胞，接种于10 cm培养皿中，待细胞汇合度达80%左右时，加入CN-3药液至不同浓度(0 μM、3 μM、6 μM)，处理24小时。收集细胞，用全蛋白提取试剂盒提取蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白定量，制备蛋白样品，10%聚丙烯胺-SDS凝胶电泳/12%聚丙烯胺-SDS凝胶电泳后冰浴中转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1小时，加入一抗(1∶1000)4℃孵育过夜，PBST洗3次，加入二抗(1∶1000)室温孵育1小时，PBST洗3次。加入ECL化学发光液后放入全自动化学发光图像分析系统中曝光。

1.9 统计分析

2 结果

2.1 CN-3剂量依赖性抑制胶质瘤U251及LN229细胞增殖

采用CCK-8法检测给予不同浓度(0.25 μM，0.5 μM，1 μM，2 μM，4 μM，8 μM，16 μM)的CN-3药液24小时后细胞的增殖情况。结果显示，与空白对照组相比，CN-3呈剂量依赖性抑制胶质瘤U251及LN229细胞增殖。计算CN-3对胶质瘤U251及LN229细胞的抑制率，进而计算CN-3在24小时抑制U251和LN229细胞的IC50值分别为4.587 μM与3.066 μM。见表1、表2，图2。

表1 CCK-8法分析CN-3对胶质瘤LN229细胞的抑制率

表2 CCK-8法分析CN-3对胶质瘤U251细胞的抑制率

2.2 CN-3对胶质瘤细胞U251细胞膜的影响

在光镜下可见CN-3低剂量组在浓度为3 μM的药液处理12小时时，与空白对照组相比，U251细胞整体形态出现皱缩现象，细胞膜发生肿胀，局部形成凸出物，见图3(如箭头所示)。在电镜下可见CN-3处理后，与空白对照组相比，U251细胞膜失去完整性，呈现断裂、孔隙状形态学改变，见图4(如箭头所示)。

注：A CN-3对胶质瘤U251细胞抑制率图；B CN-3对胶质瘤LN229细胞抑制率图

注：A 空白对照组12小时胶质瘤U251细胞成像图；B CN-3低剂量组(3 μM)12小时胶质瘤U251细胞成像图

注：A 空白对照组胶质瘤U251细胞12000×视野电镜图； B 空白对照组胶质瘤U251细胞30000×视野电镜； C CN-3低剂量组(3 μM)胶质瘤U251细胞12000×视野电镜图； D CN-3低剂量组(3 μM)胶质瘤U251细胞30000×视野电镜图。

2.3 CN-3诱导胶质瘤U251和LN229细胞凋亡与焦亡

使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒测量不同浓度CN-3处理的LN229和U251细胞凋亡与焦亡的变化。Annexin V-/PI+表示坏死细胞，Annexin V+/PI+ 表示发生焦亡细胞，Annexin V+/PI-表示凋亡细胞，Annexin V-/PI- 表示活细胞[15]。数据表显示焦亡细胞、早期凋亡细胞和活细胞的百分比。结果表明，与空白对照组比较，3 μM的CN-3药液处理12小时后U251和LN229细胞主要表现出焦亡，6 μM的CN-3药液处理12小时后U251和LN229细胞的凋亡比例上升，见图5，表3、表4。

2.4 CN-3上调胶质瘤U251和LN229细胞中焦亡相关蛋白的表达

通过Western blot法验证了CN-3诱导胶质瘤U251和LN229细胞通过Caspase-1介导的经典途径诱导焦亡的发生。结果显示，与空白对照组相比，CN-3增加了U251和LN229细胞中NLRP3、 Cleaved Caspase-1、CleavedN-terminal-GSDMD和IL-1β蛋白的表达水平，见图6、图7，表5、表6。

图6 CN-3对胶质瘤U251细胞焦亡NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路相关蛋白表达的影响

图7 CN-3对胶质瘤LN229细胞焦亡NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路相关蛋白表达的影响

表3 流式细胞术检测CN-3对胶质瘤细胞LN229的影响

表4 流式细胞术检测CN-3对胶质瘤细胞U251的影响

表5 CN-3对各组胶质瘤细胞U251中焦亡相关蛋白的影响

注：横坐标代表Annexin V-FITC ,纵坐标代表PI。Annexin V-/PI+表示坏死细胞，Annexin V+/PI+ 表示发生焦亡细胞，Annexin V+/PI-表示早期凋亡细胞，Annexin V-/PI- 表示活细胞

表6 CN-3对各组胶质瘤细胞LN229中焦亡相关蛋白的影响

3 讨论

《中国中药资源志要》中记载海星味咸，性平，用于瘿瘤[18]。海星皂苷抗肿瘤作用机制复杂，可通过诱导线粒体凋亡、周期阻滞等抑制胶质瘤的增殖。但皂苷诱导焦亡相关研究较少。本文首次发现了海洋来源的海星皂苷CN-3诱导胶质瘤细胞焦亡。焦亡发生的过程中，在药物作用下，细胞内的模式识别受体(NLR)识别信号，通过接头蛋白ASC与Caspase-1结合，形成多蛋白复合物，激活Caspase-1，活化的Caspase-1切割激活GSDMD，诱导细胞膜穿孔、细胞破裂、内容物释放，并诱导细胞焦亡以响应肿瘤化疗药物[19-20]；此外，活化的Caspase-1对pro-IL-1β和pro-IL-18进行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并释放到胞外，募集和激活其他免疫细胞，诱导趋化因子、炎症因子、粘附分子等的合成，最终引起级联效应，导致严重的炎症反应[21]。最新研究表明，细胞焦亡具有促进和抑制肿瘤形成的双重作用[22]。然而，胶质瘤发生细胞焦亡的具体机制以及海星皂苷诱导胶质瘤细胞焦亡的预后价值仍不清楚。

本研究采用CCK-8法检测CN-3抑制胶质瘤U251和LN229细胞增殖。与空白对照组相比，低剂量CN-3组在光镜与电镜下，胶质瘤U251细胞均出现细胞膜突起，孔隙形成、质膜破裂等具有焦亡特征的形态学改变。流式细胞术检测了各组中焦亡细胞与早期凋亡细胞比例，发现低剂量CN-3处理后，胶质瘤U251和LN229细胞发生焦亡的细胞比例较高，而在高剂量CN-3处理后凋亡细胞比例上升。这表明CN-3可诱导胶质瘤U251和LN229细胞焦亡，并且不同剂量CN-3发挥的抗胶质瘤作用机制可能不尽相同。Western blot结果显示，与空白对照组比较，CN-3可显著上调胶质瘤U251和LN229细胞中Cleaved Caspase-1、CleavedN-terminal-GSDMD、mature-IL-1β和NLRP3蛋白的表达，诱导胶质瘤细胞发生焦亡。提示CN-3可通过NLRP3/Casapse-1/GSDMD经典通路诱导焦亡发生。

本文主要发现低浓度CN-3作用于胶质瘤细胞后，可首先诱发经典焦亡途径发挥抗胶质瘤细胞的功能，从而使得对皂苷抗胶质瘤的作用机制有了更深入的理解，也为抗胶质瘤皂苷CN-3今后的新药开发及临床应用提供了新的实验依据。