miR-326的功能及其在自身免疫病中作用的研究进展①

徐 璐 王丽华 卢晓宇 王健健 张荟雪 （哈尔滨医科大学附属第二医院神经内科，哈尔滨 150081）

免疫系统是一种可防止病原体侵害机体的复杂机制，其通过巨噬细胞和树突状细胞的吞噬作用清除体内变形、衰老的细胞及免疫复合物等，同时对自身成分保持耐受。然而，当免疫开始向病原性自身免疫发展时，机体的免疫稳态将被打破，最终导致自身免疫病（autoimmune disease，AD）［1］。近年来，国内外研究者发现各类微小RNA（microRNA，miRNA）介导多种AD 甚至肿瘤等病理过程，其中，miR-326 在AD 中的作用已引起广泛关注。DU 等［2］在对多发性硬化（multiple sclerosis，MS）患者和自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encepha‐lomyelitis，EAE）动物模型的研究中均发现miR-326表达明显升高；SEBASTIANI 等［3］研究证实1 型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）患者外周血中miR-326 表达显著增高；此外，SUN 等［4］在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）、ZHAO等［5］和LIU 等［6］在自身免疫性甲状腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT）中也报道了类似的发现。而LIU等［7］在针对免疫性血小板减少症（immune thrombocyto‐penia，ITP）患者的研究中则发现miR-326 表达明显下调，以上研究均表明miR-326在AD中发挥至关重要的作用。本文从miR-326 的功能及作用机制入手，对miR-326 在AD 中的研究进展进行综述，旨在为AD的研究提供新思路。

1 miRNA的表达与功能

全基因组转录组谱分析揭示了人类基因组中存在miRNA，miRNA 是一类由18~25 个核苷酸组成的单链小分子非编码RNA，其广泛存在于基因调控、表观遗传基因调控和蛋白质功能调控的各个阶段［8］。据估计，人类基因组中大约有1 500个miRNAs，这些miRNAs 潜在调节20%~30%的人类基因［9］。miRNA 的生物发生包括一系列成熟步骤：miRNA 首先通过RNA 聚合酶Ⅱ在细胞核中转录为初级mi-RNA（pri-miRNA），pri-miRNA 被酶-蛋白质微处理器复合物识别并切割为70~100 个核苷酸长的前体miRNA（pre-miRNA），这些pre-miRNA 被转运至细胞质后，Dicer（RNA 聚合酶Ⅲ家族成员）与其5'及3'末端相互作用，进一步切割以产生20个核苷酸长的miRNA/miRNA 双链体，此双链体被Argonaute 蛋白（AGO）整合到RNA 诱导的沉默复合体（RNA-in‐duced silencing complex，RISC）上，后者提供了引导miRNA 链锚定至靶标mRNA 的作用，在此过程中，与引导链互补的miRNA 链降解并允许引导链mi-RNA 与靶mRNA 的3'端非编码区（untranslated re‐gions，UTR）相互作用以调节其表达［10］。一旦引导链miRNA 和靶基因mRNA 间的互补碱基匹配并稳定，RISC 复合体的AGO 蛋白就会诱导靶mRNA 的内切核酸裂解，从而导致mRNA 降解，发挥负性调控基因表达作用［11］。miRNA 不仅可与靶基因mRNA 的3'UTR 互补结合导致mRNA 降解或翻译沉默，也可与靶基因的5'UTR、启动子或编码区结合［12］。

随着基因组学技术，特别是高通量基因测序的发展，miRNA 的作用已出现在各种生物学过程中，如细胞分化、凋亡、染色质重塑、转录后翻译修饰、蛋白质转运等。此外，miRNA 在大多数基因调控途径的转录后水平中发挥关键作用，调节先天和适应性免疫应答，通过改变免疫应答在AD 甚至肿瘤的发病中发挥重要作用［13］。

2 miRNA在AD中的作用及研究现状

miRNA 在先天免疫的不同方面发挥重要作用，如控制并杀死微生物、介导细胞因子的产生等。此外，miRNA 也被确认在不同类型的效应性T 辅助细胞亚群，如T 辅助细胞（Th1、Th2、Th17、Th9）、滤泡性T 辅助细胞和调节性T 细胞（Treg）中发挥至关重要的作用。这些效应性T辅助细胞在炎症反应中可诱导和抑制miRNA 表达进而产生促炎或抗炎作用，因此，它们是炎症的关键调控因子［14］。一些细胞因子，如IFN-γ 和IL-17 在T 细胞中产生，负责Th1 和Th17 的分化，已被证明参与AD 的病理过程［15］。miRNA 是正常免疫T 细胞功能所必需的，一些特定的miRNAs与T细胞的功能或发育直接或间接相关，包括CD8+T 细胞（miR-150、miR-21 和miR-155）、Th2（miR-150 或miR-146a）、Th1（miR-147 或miR-155）和Th17等［16］。

在免疫细胞发育过程中，miRNA 调控紊乱可能导致AD 发生。例如，miR-155 在MS 中高表达［17］；miR-146a 在T1DM 及SLE 中均显著下调［18］；miR-21在MS 患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中表达增加，与此同时还发现miR-21 缺陷型小鼠对EAE 的发生具有抵抗性［19-20］。另外，在牛皮癣及炎症性肠病患者中也发现miR-21 表达增加［21］。除以上几种miRNAs 外，还有其他miRNAs 通过调节T 淋巴细胞分化在自身免疫中发挥重要作用，如miR-27a 可抑制Th17 分化，因而在MS 中被下调［22］。还有研究者提出，miR-140-5p 通过抑制转录因子STAT1 的激活来抑制Th1分化，从而提供了针对MS 发生的保护作用［23］。然而，大多数miRNAs 在体内的功能是未知的，研究miRNA 在AD 中的作用不仅有助于了解这些疾病的发病机制，而且有助于探寻预防和治疗这类严重疾病的方法。

3 miR-326的概述

miR-326是含有20个由11号染色体内含子1编码的核苷酸，最初被鉴定为神经元中的一种神经特异性miRNA，在转录后水平调控宿主基因组表达方面发挥关键作用，并发现其表达可能与抑制素基因（β基因）表达呈正相关［24］。近年来，miR-326得到了广泛研究，其在免疫稳态的成熟、分化和维持等过程中发挥重要作用［25-26］。生物信息学研究显示miR-326 的靶基因有整合素金属蛋白酶17（ADAM17）、CD47、Ets-1、GLI1、IL-17、丙酮酸激酶M2（PKM2）、PTEN、维生素D3 受体（VDR）等［27］。在miR-326 介导的AD 中，VDR、CD47、Ets-1 是研究最为广泛的3 种靶基因。其中，VDR 参与调节免疫细胞稳态的维持，miR-326 基因过表达可抑制免疫细胞中VDR的表达进而诱发某些AD 发生［3］；CD47 作为一种跨膜蛋白，在控制和迁移巨噬细胞吞噬中起主要作用，这种作用在一些AD中能够促进Th17的分化［28］；Ets-1 是一种可直接调节细胞因子和趋化因子基因表达的转录因子，主要功能是调节淋巴样细胞分化和增殖。Ets-1 参与调节体内免疫细胞的平衡，是Th17 分化的反向调节因子，其通过自身表现的“抗miR-326”属性而被视为miR-326的功能靶标［29］。此外，KEFAS 等［30-31］发现miR-326 通过靶向调控Notch1/2 及PKM2 从而削弱多种细胞的增殖和侵袭。而MØLLER 等［32］认为miR-326 与Notch 是以负反馈的方式相互调节，即miR-326 直接调节Notch-1的表达，而其本身又可受到反馈环路的调节。miR-326 下调可能改变细胞的生长、侵袭和代谢活性这一理论还需深入研究。此外，Wnt 信号通路也被认为与AD 密切相关［33］，然而，miR-326 与Wnt 信号通路在介导AD 的发病中是否存在联系，仍有待进一步证明。

4 miR-326在AD中的研究

4.1 miR-326与MS MS是一种慢性炎症性脱髓鞘中枢神经系统疾病，其机制是由于人体免疫系统异常攻击神经髓鞘，引起炎症及相关损伤，进而破坏大脑、视神经和脊髓的正常功能，最终导致神经系统功能恶化［34］。DU 等［2］研究发现，miR-326 的表达与MS 患者和EAE 小鼠的疾病严重程度高度相关，在体内沉默miR-326 可导致Th17 减少和EAE 减轻，而其过表达可导致Th17细胞增殖和EAE症状加重，这可能是由于miR-326 通过靶向调控Th17 细胞分化的负性调控因子Ets-1，从而促进了Th17 细胞分化。miRNA 表达谱分析显示，在MS 患者的PBMC、全血、血清中miR-326 水平均可能发生改变［35］。然而，MATHEW 等［36］分析了59例MS患者和37例健康对照者外周血样本中27 种miRNAs 的表达，结果显示miR-326 的表达在MS 病例组及健康对照组中无明显差别。此外，MOHAMMAD 等［37］认为miR-326可用于区分MS的复发期和缓解期，且miR-326可通过影响TGF-β 信号传导途径促进Th17 细胞分化。综上，miR-326 的表达水平可能预测MS 的发病，其靶基因Ets-1在其中发挥重要作用，但其分子机制及其与其他炎症相关通路的关系仍未完全阐明，且miR-326 的其他靶基因是否也参与MS 的发病有待深入研究。

4.2 miR-326 与T1DM T1DM 是一种多基因参与的AD，其特征是自身免疫反应攻击胰岛β细胞进而导致胰岛素分泌不足。VDR 由大量免疫细胞，如活化的T 细胞产生，VDR 多态性导致的VDR 功能改变已被引入包括T1DM 等AD 的发病机制中［38］。SEBASTIANI 等［3］在一项针对19 例T1DM 患者的研究中发现，miR-326 过表达可能会导致免疫细胞中VDR 下调；ZIPITIS 等［39］研究发现与未补充维生素D（VD）的婴儿相比，补充VD 的婴儿长大后罹患T1DM 的风险降低29%，且在T1DM 动物模型中使用高剂量VD 或VD 类似物时，可预防糖尿病或抑制其进展。此外，有研究报道抑制肌营养蛋白基因（Mtpn）会导致胰岛素分泌减少，AZHIR 等［40］研究表明，miR-326过表达可能导致Mtpn表达下调。同时，miR-326过表达可能通过促进Th17细胞分化进而参与T1DM 的致病性。因此，进一步探索miR-326 与VDR、Mtpn 对Th17 细胞的影响，有望阐明T1DM 的发病机制，并为靶向治疗甚至预防T1DM 提供有效策略。

4.3 miR-326 与SLE SLE 是一种慢性、多系统性、复杂的AD，可影响多个组织和器官，且具有不同的临床表现［41］。尽管尚未阐明SLE 的确切病因，但遗传、环境、内分泌和其他因素可能在SLE的发生发展中发挥重要作用［42］。T 淋巴细胞不仅可通过直接接触影响其他免疫细胞，还可通过分泌促炎症细胞因子并直接作用于靶组织来参与SLE 发展，但其与miR-326的关系有待证明［43］。此外，B淋巴细胞被认为是SLE 发病的主要参与者，XIA 等［44］认为MRL/lpr小鼠中的miR-326 过表达可导致B 淋巴细胞过度活化和严重的SLE。进一步研究发现，SLE中B淋巴细胞内升高的miR-326 通过下调Ets-1 促进浆细胞发育和抗体产生。CHEN 等［45］在一项针对8 例SLE 患者的研究中发现其miR-155、miR-223、miR-224、miR-326 及miR-342 表达均升高。此外，SUN 等［4］通过一项针对53例SLE 患者的研究中描述了miR-326过表达可导致Ets-1 mRNA 水平降低。综上，miR-326 的表达水平可能与SLE 症状呈正相关，理论上，通过靶向抑制miR-326 的表达进而有效抑制SLE 患者体内自身免疫反应的产生，有望使SLE 取得满意疗效。然而，这有待通过完善SLE 动物模型及设计体内实验来进一步证实。

4.4 miR-326 与AIT AIT 是最常见的AD 之一，桥本甲状腺炎（Hashimoto thyroiditis，HT）是一种主要的AIT，HT 的病理特征是淋巴细胞浸润和甲状腺滤泡组织病变，HT患者的血清循环甲状腺抗体主要是抗甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAbs）和甲状腺球蛋白抗体（TgAbs），可导致甲状腺纤维化或萎缩并伴有甲状腺功能减退［46］。ZHAO 等［5］通过建立碘诱导的AIT小鼠模型证明miR-326高表达可使Th17显著增加，且miR-326抑制Ets-1蛋白表达能够促进Th17细胞分化，最终促进碘化物诱发AIT。LIU 等［6］研究发现，HT 患者miR-326 表达水平升高，随着PBMC中miR-326的过表达，Th17细胞的分化得以增强，与此同时，HT 患者的ADAM17 表达降低，基于以上发现，miR-326 可能通过靶向抑制ADAM17 参与HT 发病。提示深入研究miR-326 介导ADAM17 与Ets-1的表达关系是靶向治疗HT 的新思路。值得注意的是，研究者发现AIT 患者还经常患有其他AD，如T1DM、SLE、慢性自身免疫性胃炎等［47］，提示miR-326 介导AD 发病可能存在共同通路，且其他AD 的发病机制研究有望为AIT的研究提供新依据。

4.5 miR-326 与ITP ITP 是一种自身免疫介导的血小板破坏和血小板生成受损的AD。目前，miR-326参与ITP的发病机制还处于初步探索阶段，其表达水平可能与ITP 严重程度呈负相关。LIU 等［7］在46 例ITP 患者和39 例健康对照者的Th 细胞亚群中的研究显示，ITP 患者中miR-146a、miR-326 和miR-142-3p 表达减少。值得注意的是，miR-326 被证实可通过在体外储存单采血小板的方式调节抗凋亡基因（Bcl-xL）在血小板中的表达［48］。表明Bcl-xL 也可能是miR-326 的靶基因，且过表达miR-326 有望治疗ITP，二者在ITP 中的作用值得深入研究。同时，上调miR-326 在其他AD 中的副作用也不容忽视。此外，万红等［49］研究证实，汉族人群PTPN22、TNF-α 基因多态性均可影响ITP 的发生风险，其中PTPN22 的1 123 位点G 突变、TNF-α 863 位点A 突变等均是ITP的危险因素，这些突变是否与miR-326的异常表达相关有待继续深入研究。

5 miR-326与肿瘤等其他疾病

研究证实miR-326通过抑制细胞增殖、迁移、侵袭并诱导细胞凋亡从而发挥抑癌作用。miR-326 作为肿瘤抑制因子参与了如非小细胞肺癌、食管鳞状细胞癌、胶质母细胞瘤等的形成和进展［50-52］。例如miR-326 还可显著抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭［50］；miR-326 可靶向抑制MAPK/MEK 信号通路的激活，从而影响食管鳞状癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡［51］；且miR-326 在胶质母细胞瘤组织中表达水平降低，并可能调节神经胶质瘤和神经胶质瘤干细胞的代谢活性［52］。提示miR-326有望成为多种肿瘤的潜在生物标志物和治疗靶点，但如何平衡miR-326 在抗肿瘤细胞增殖的同时可能诱导AD 的产生，无疑是未来研究的难点与突破点。此外，miR-326 在脓毒血症患者中也存在异常表达［53］，这些都为深入研究miR-326 在AD 中的作用提供了更多方向。

6 展望

综上所述，miR-326 与AD 的发生发展关系密切，但其表达水平和介导的靶基因在不同AD 中各有差异，深入研究miR-326与其各类靶基因在AD中的作用，有望为AD 的靶向治疗提供新依据，然而，目前miR-326在AD中的研究还处于初步探索阶段，仍有待通过完善AD 动物模型和体内实验方案进一步阐明。此外，值得注意的是，因为miR-326的肿瘤抑制作用，下调其表达可能导致肿瘤细胞增殖。因此，探究miR-326在介导AD中的敏感靶基因及信号转导通路是未来重要的研究方向。