胰腺癌相关成纤维细胞的靶向调控进展

仝宇晴，杨梦楠，霍美蓉，殷婷婕

(中国药科大学药学院药剂系，江苏 南京 211198)

胰腺癌极具侵袭力是最致命的恶性肿瘤之一，5年生存率至今不足10%[1]。胰腺癌肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)不但支持胰腺癌的发生、进展和转移过程，也是导致胰腺癌耐药的重要原因。胰腺癌纤维结缔组织过度增生，基质成分占瘤体积的90%以上，是胰腺癌TME最显著的特征[2]。胰腺癌相关成纤维细胞(pancreatic cancer-associated fibroblasts,PCAFs)是胰腺癌TME中最主要的细胞成分之一，能大量分泌胶原蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖和透明质酸等细胞外基质(extracellular matrix,ECM)成分，是胰腺癌纤维结缔组织过度增生的主要贡献者[3]。致密增生的肿瘤基质不仅限制药物瘤内的递送和渗透，亦具有生物活性，可直接支持肿瘤细胞的存活、增殖和转移[3-4]。此外，PCAFs也能通过旁分泌多种可溶性细胞因子和趋化因子增强肿瘤细胞活性和治疗抗性，并调节多种免疫细胞的功能和瘤内浸润，促进免疫抑制性TME的形成和维持[5]。鉴于PCAFs的多功能性，针对PCAFs进行靶向调控有望介导TME的整体重塑，并提升现有疗法对胰腺癌的治疗效果。

1 PCAFs概述

由于特异性生物标志物的缺乏，PCAFs尚无明确定义。PCAFs通常指存在于胰腺肿瘤组织中的，具有细长形态，不表达上皮细胞、内皮细胞和白细胞的标志物，也没有胰腺癌细胞所具有的基因突变的一类细胞[6]。

1.1 PCAFs的特点 PCAFs具有多种来源，胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells,PSCs)、间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)和胰腺组织中的正常成纤维细胞均能在胰腺癌发生发展过程中活化或分化为PCAFs[5]。其中，PSCs是胰腺癌TME中含量最丰富的细胞，约占细胞总数的50%，能在胰腺癌TME刺激下激活呈PCAFs表型，是PCAFs的主要来源[7]。PCAFs也是一个具有高度异质性的细胞群体，主要包括肌成纤维性PCAFs(myofibroblastic PCAFs,myPCAFs)、炎性PCAFs (inflammatory PCAFs,iPCAFs)、抗原呈递性PCAFs(antigen-presenting PCAFs,apPCAFs)和高代谢性PCAFs(highly activated metabolic state PCAFs,mePCAFs)[5,8]。不同表型的PCAFs在胰腺癌TME中空间分布不同，且具有不同的生理特性：myPCAFs紧邻肿瘤细胞，表达高水平α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)；iPCAFs远离肿瘤细胞，α-SMA表达水平低，但大量分泌IL-6等炎性细胞因子；apPCAFs表达MHC II和CD74，具有抗原呈递作用；mePCAFs具有高度活跃的糖酵解作用，其代谢中间体能为瘤内肿瘤细胞和免疫细胞的氧化磷酸化提供碳源。此外，PCAFs还具有可塑性，能受其在胰腺癌TME中的空间分布和环境刺激发生不同表型之间的转化[6]。

1.2 PCAFs在胰腺癌中的多重作用 胰腺癌细胞分泌的以转化生长因子-β(TGF-β)为代表的多种细胞因子，以及TME缺氧、酸性及氧化应激条件均能促进静息态PSCs、MSCs和正常成纤维细胞激活为PCAFs[7]。PCAFs激活后，又能通过分泌细胞因子(胰岛素样生长因子、表皮生长因子和白血病抑制因子等)、趋化因子(CXCL12等)、丙氨酸和外泌体等来增强胰腺癌细胞的增殖、侵袭能力，并促进癌细胞干性的产生[5]。PCAFs也与胰腺癌对化疗和放疗的抗性相关：PCAFs通过表达富含半胱氨酸的血管生成诱导剂 61(CYR 61)上调核苷转运蛋白hENT1和hCNT3，增加自身对胰腺癌一线化疗药物吉西他滨的摄取，减少胰腺癌细胞摄取吉西他滨；PCAFs高表达骨膜蛋白，骨膜蛋白能通过调控蛋白激酶B(Akt)和细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路降低胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性；PCAFs通过产生ECM激活胰腺癌细胞的整合素β1-黏着斑激酶信号通路，保护癌细胞免受放疗伤害[7,9]。

除了与胰腺癌细胞发生双向串扰外，PCAFs还能与多种免疫细胞发生串扰，促进免疫抑制型TME的形成和维持：通过分泌CXCL12促进调节性T细胞向瘤内募集；通过分泌M-CSF、IL-4和IL-13促进巨噬细胞向具有免疫抑制作用的M2型极化；分泌IL-6、M-CSF等细胞因子促进髓源性抑制细胞的产生；分泌TGF-β等细胞因子抑制树突状细胞的激活[5,7]。

2 可抑制PCAFs活性的药物

PCAFs调控策略主要可分为：PCAFs耗竭；抑制PCAFs活性；抑制PCAFs的某些特定功能。PCAFs耗竭策略已在临床实验中被证实会加速肿瘤生长和进展[10]；抑制PCAFs的某些特定功能(如沉默PCAFs的胶原分泌相关基因等)则效果有限[11]；相较而言，通过阻断促PCAFs活化信号、阻断PCAFs胞内信号传导等方式抑制PCAFs活性，最有望用于增效胰腺癌治疗。因此，本节仅对PCAFs可抑制PCAFs活性的药物进行整理。

靶向调控TGF-β相关信号通路是应用最广的PCAFs活性抑制策略。雷公藤内酯的水溶性前药Minnelide[12]、吡非尼酮[13]、α-倒捻子素[14]、梣酮[15]、松弛素[16]、一氧化氮[17]和miRNA-29[18]等能抑制PCAFs中的TGF-β/Smads信号通路的转导；LY2109761[19]、galunisertib[20]和vactosertib[21]等能抑制PSCs上的TGF-β受体表达；二甲双胍则能通过下调胰腺癌细胞中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路来抑制TGF-β的表达[22]。以上药物均可有效抑制PCAFs活化或诱导PCAFs失活。

除TGF-β信号通路外，TNF-α、IL-6、IL-1、CTGF和Hedgehog等细胞因子相关信号通路的激活也是诱导PCAFs活化的重要因素[5]。肿瘤疫苗GV1001能通过减少TNF-α、IL-6和IL-1β的产生来抑制PSCs活化[23]。靶向CTGF的单克隆抗体FG-3019及IL-1受体拮抗剂Anakinra也均具有抑制PSCs活化的能力[24,25]。

胰腺癌瘤内有氧含量匮乏亦是导致PSCs活化的重要刺激因素之一[7]。缺氧刺激下，细胞内miR-210表达上升，miR-210能通过调节多条信号通路促进细胞适应缺氧微环境，利用miRNA抑制剂(anti-miR-210)沉默PSCs中的miR-210可以成功诱导PSCs的失活[26]。

静息态的PSCs富含维生素A，同时也是人类、大鼠和小鼠胰腺组织中唯一富含维生素A的细胞，但在活化过程中会发生维生素A丢失[27]。全反式维A酸(ATRA)是一种维生素A的衍生物，能通过抑制视黄酸受体-β/肌动球蛋白-2、Wnt/β-连环蛋白信号通路以及引起G1期细胞周期阻滞等多种机制静息PSCs，恢复PSCs的维生素A贮存能力并减少结缔组织的分泌[28-29]。

维生素D受体(VDR)表达水平低或体循环维生素D水平低(<20 ng·mL-1)均与胰腺癌的不良预后相关[30]。VDR是介导PSCs静息的主要转录调节因子，帕立骨化醇、骨化三醇和卡泊三醇等维生素D类似物能通过持续激活维生素D受体来诱导PSCs静息，减轻瘤内纤维化并抑制PSCs与肿瘤干细胞之间的串扰，增效胰腺癌化疗效果[30-32]。

血管紧张素Ⅱ(ATⅡ)具有促进PSCs增殖、迁移及诱导ECM产生的能力，奥美沙坦和氯沙坦等ATⅡ抑制剂能通过阻断ATⅡ的Ⅰ型受体所介导的促纤维信号(如TGF-β1、CTGF和内皮素等)来抑制PSCs的活性，并减少ECM的产生[33-34]。

血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)在与其受体结合后，能通过激活内源性酪氨酸磷酸化，进而上调ERK和Akt信号通路来促进PSCs增殖和迁移[35]。PSCs所分泌的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)具有促进巨噬细胞向肿瘤组织募集的作用，在免疫抑制性TME的形成中扮演着重要角色，也能诱导成纤维细胞分泌ECM[36-37]。天然多酚化合物鞣花酸通过多种机制抑制PSCs的功能：不但能抑制PDGF-BB诱导的PSCs增殖和迁移，还能抑制IL-1β和TNF-α诱导的MCP-1的产生，以及下调α-SMA和胶原编码基因的表达[38]。

PSCs与单核-巨噬细胞谱系(MML)的细胞有许多共同特征，如都具有吞噬活性，并表达多种Toll 样受体，还具备MML细胞特异性标志物α-萘基丁酸酯酶(ANBE)活性[39-40]。Gonzalez-Villasana等[40]发现MML抑制剂双膦酸盐(帕米膦酸盐或唑来膦酸)可以抑制 PSCs的增殖、活化、MCP-1的释放、Ⅰ型胶原蛋白的表达，以及促进PSCs凋亡并诱导PSCs的细胞周期停滞于G1期。

3 可提高PCAFs药物靶向递送效率的策略

基于纳米技术的药物递送系统(drug delivery systems,DDS)在临床及临床前研究中已被广泛用于改善药物的溶解度、生物利用度、靶向效率和毒副作用等。用于递送PCAFs调控药物的DDS需要充分结合胰腺癌的生理病理特征合理设计，才能实现针对PCAFs的高效靶向调控，进而增效抗胰腺癌疗法。

3.1 促进药物靶向蓄积于PCAFs周围 PCAFs靶向调控剂首先可被递送至PCAFs周围以利于药物接触靶细胞。具有肿瘤基质主动靶向能力、主动跨血管能力和肿瘤深层渗透能力的DDS，以及消融过度增生的ECM均能有望通过提升瘤内局部药物浓度，增加PCAFs对药物的可及性来提升其调控作用。

靶向肿瘤基质中高表达的特异性生物分子(如蛋白聚糖、纤连蛋白等)能促进药物蓄积在PCAFs周围，增加PCAFs的药物摄取概率。KRAS是一种参与细胞增殖和存活的重要原癌基因，KRAS突变会引起细胞失去生长增殖限制，导致肿瘤发生。超过90%的胰腺癌病例携带KRAS突变，靶向KRAS已成为胰腺癌治疗的研究热点。Pei等[15]通过CGKRK修饰型聚乙二醇-聚乳酸共聚物负载抗纤维化药物梣酮(Frax)，制备了纳米药物Frax-NP-CGKRK，还通过以载脂蛋白E3(ApoE3)作为靶头的脂质磷酸钙纳米粒荷载siKRAS，制备了仿生纳米粒siKras-LCP-ApoE3。CGKRK赋予Frax-NP-CGKRK主动靶向胰腺癌内过表达的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的能力，高效抑制TGF-β信号通路，抑制PCAFs活性。ApoE3能与胰腺癌细胞中过表达的低密度脂蛋白受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白1特异性结合，促进胰腺癌细胞摄取siKras-LCP-ApoE3，进而高效沉默胰腺癌细胞中的KRAS表达。体内药效学研究显示，Frax-NP-CGKRK具有削弱致密基质屏障及增强肿瘤血液灌注的效果，与具有KRAS沉默作用的仿生纳米粒siKras-LCP-ApoE3序贯给药，可使得荷瘤小鼠中位生存期较单用吉西他滨延长77.5%。

仅依赖实体瘤组织增强的渗透性和滞留(EPR)效应所实现的纳米药物肿瘤蓄积效果有限，设计具有主动跨肿瘤血管作用的DDS对于提升瘤内局部药物浓度具有重要意义。白蛋白能通过肿瘤血管内皮细胞表面高表达的gp60受体所介导的转胞吞作用进入肿瘤，并与瘤内高表达的富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC)相结合而蓄积在肿瘤基质中[41]。Desai等[42]发现Abraxane©介导的紫杉醇瘤内蓄积量较Taxol©高33%。临床实验证实Abraxane©与吉西他滨联合给药方案相比于吉西他滨单药疗法能显著延长晚期胰腺癌患者的中位生存期(8.5个月vs 6.7个月)，此联用方案已成为晚期胰腺癌的一线疗法[43]。肿瘤穿透肽也具有主动跨血管作用，Liu等[44]设计了一种iRGD修饰的介孔硅纳米粒负载伊立替康用于治疗胰腺癌，此DDS较非iRGD修饰的介孔硅纳米粒瘤内蓄积量提升50%以上，且蓄积量与肿瘤血管表面的神经纤毛蛋白(NRP-1)的丰度呈正相关。

直径100 nm左右的纳米粒具有较好的长循环能力，却不能在基质致密增生型肿瘤中实现有效内渗[45]。Zhao等[21]构建了一种尺寸可变的APTEDB-NS-TAX@Lipo-VAC纳米粒，由PEG-PLGA纳米球封装于靶向纤连蛋白的脂质体中构建而成，用于共递TGF-β受体抑制剂vactosertib(VAC)和化疗药物紫杉醇(TAX)治疗胰腺癌。VAC和TAX分别被封装于脂质体的疏水层及PEG-PLGA纳米球中。APTEDB-NS-TAX@Lipo-VAC能与纤连蛋白剪接的胞外域B结合并蓄积在肿瘤基质中，逐渐释放VAC，进而抑制PSCs产生ECM，减小基质密度。在脂质体塌陷后，负载TAX的40 nm PEG-LPGA纳米球能渗透入肿瘤深处，有利于TAX杀伤深处肿瘤细胞。体内药效学研究表明APTEDB-NS-TAX@Lipo-VAC高效削弱致密的肿瘤基质，促进纳米粒和小分子的瘤内渗透，肿瘤抑制率高达67.5%。

带阳离子的DDS能通过吸附诱导的转胞吞作用同时实现药物的跨肿瘤血管穿透和瘤内深层渗透。然而，由于生理环境中存在大量带负电荷的物质，阳离子DDS在血液循环中极不稳定。Zhou等[46]利用血管内皮细胞和肿瘤细胞表面高表达γ-谷氨酰转肽酶(GGT)的特点，设计了一种可响应于GGT发生电荷反转的两性离子聚合物-喜树碱偶联物(PBEAGA-CPT)。PBEAGA末端为谷氨酸，生理条件下带负电荷，在GGT催化下会脱去谷氨酸并暴露出一个伯氨基末端，此伯氨基可在肿瘤弱酸性微环境中质子化而带正电荷。因此，PBEAGA-CPT偶联物在体循环中带负电荷，在与肿瘤血管内皮细胞或肿瘤细胞接触时，PBEAGA-CPT中的伯氨基在GGT催化下发生质子化，电荷反转为正，引发转胞吞作用，成功实现药物的跨肿瘤血管和瘤内深层渗透，显著增强了CPT对大体积(～ 500 mm3)肝癌和胰腺癌的治疗效果。

使用酶(透明质酸酶、胶原酶等)直接消融肿瘤ECM有利于增加药物于胰腺癌内的蓄积。Zinger等[47]证实了瘤内胶原蛋白的消融能增加后续纳米药物的瘤内蓄积，增强纳米药物的抗胰腺癌效果：荷瘤小鼠在予以胶原酶脂质体治疗后，瘤内胶原含量下降且组织网孔密度降低，多种纳米粒(30 nm胶束、100 nm金纳米粒及脂质体)瘤内蓄积增加。类似地，Zhou等[48]通过将透明质酸酶直接嵌入纳米粒外壳成功提升了纳米粒的肿瘤蓄积量。

3.2 增加PCAFs对药物的靶向摄取 由于PCAFs靶向调节剂的作用靶点几乎都在胞内，因此除促进药物蓄积于PCAFs周围外，促进药物靶向入胞是进一步提升PCAFs靶向调控效率的必要条件。

转铁蛋白受体1(CD71)在胰腺癌细胞及PSCs表面均高表达，Liu等[49]将具有CD71靶向性的核酸适体“XQ-2d”、磷酸化酪氨酸识别和结合能力的SH2超结合子“SH2 CM”及细胞穿透肽“(Arg)9”相偶联，制备了XQ-2d-His-SH2 CM-(Arg)9偶联物，XQ-2d赋予该偶联物精确靶向胰腺癌细胞和PSCs的能力，(Arg)9则能增加偶联物的入胞效率，“SH2 CM”则具有阻断胞内磷酸化酪氨酸相关信号通路的能力。体外药效学研究表明，XQ-2d-His-SH2 CM-(Arg)9偶联物既能高效阻断人胰腺癌细胞PANC-1和BxPC-3胞内EGFR、VEGFR2、IGF-1R、Src、AKT和ERK1/2等多条磷酸化酪氨酸相关的信号通路，有效抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移，又能通过降低PSCs胞内STAT3、Smad2/3和ERK1/2的磷酸化水平，诱导PSCs静息，减少α-SMA、纤连蛋白和I型胶原蛋白等ECM分泌。XQ-2d-His-SH2 CM-(Arg)9偶联物在体内研究中显示了较非靶向组更优越的抑癌能力。

Huang等[17]构建了一种胰腺癌基质靶向纳米凝胶LQT-TRAIL-NO@Nanogel，该纳米凝胶具有“核-壳”结构，内核由蚕丝蛋白荷载肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)而成，外壳为PLGA-脂质杂化物，NO供体被包裹于PLGA层中，最外部修饰了由噬菌体展示技术筛选出的PSCs靶向肽LQT。LQT-TRAIL-NO@Nanogel能将NO供体及TRAIL特异性地靶向递送至胰腺肿瘤中，在削弱胰腺癌致密基质的同时，克服胰腺癌对TRAIL的耐药性：LQT增强PSCs的摄取效率，使NO供体发挥了高效的PSCs重塑能力，有效减轻胰腺癌结缔组织增生，促进TRAIL瘤内渗透，NO还可通过下调肿瘤细胞中Bcl-2的表达来阻断其抗凋亡特性，增强TRAIL诱导的肿瘤细胞凋亡，协同TRAIL的抗胰腺癌作用。体内药效学评价显示，LQT-TRAIL-NO@Nanogel在小鼠胰腺癌原位同种移植模型(AK4.4及KPC001)和人胰腺癌原位异种移植模型(AsPC-1)中均显著削弱癌基质，并在AK4.4模型中增强了TRAIL的疗效。

3.3 进一步优化靶向释药行为 DDS蓄积在PCAFs周围或被摄入胞内后，需进一步实现高效的药物释放才能充分发挥PCAFs靶向调控作用。结合外源性刺激(热、磁场和超声波等)或TME内特殊的生理刺激(如酶、酸、ROS、GSH和ATP等)，在前述药物递送策略基础上进一步引入响应型控释设计，优化释药行为，有利于更高效的PCAFs靶向调控。

基质金属蛋白酶-2(MMP-2)在正常组织表达量很低，但在肿瘤基质、PSCs和肿瘤细胞中过度表达。Ji等[13]通过MMP-2响应性的脂质体负载吡非尼酮制备了一种能同时调控PSCs及胰腺癌细胞的纳米粒MRPL，MRPL可响应于肿瘤基质、PSCs和肿瘤细胞中过表达的MMP-2释放PFD，下调PSCs所表达的纤连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、生腱蛋白C和蛋白聚糖等多种ECM成分。体内药效学研究显示，肿瘤经MRPL治疗后，基质致密程度减弱，小分子瘤内渗透深度达到对照组的9.2倍，吉西他滨的瘤内蓄积量达到对照组的3倍，肿瘤凋亡面积达到对照组的2.9倍，吉西他滨的抗胰腺癌作用得到显著增强。

Duan等[32]设计了一种能被膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)激活的智能脂质体MR-T-PD，分别向肿瘤血管内皮细胞递送低密度cRGDfK，向胰腺癌细胞递送阿霉素(DOX)，以及向PSCs递送磷酸化卡泊三醇(PCAL)。MR-T-PD能被肿瘤内皮细胞表面的MT1-MMP选择性激活并释放低密度cRGDfK，特异性促进血管生成，从而增强MR-T-PD于乏血供胰腺癌的瘤内递送量；MR-T-PD则能在肿瘤局部加热条件下释放DOX诱导肿瘤细胞凋亡；而PCAL在PSCs表面的碱性磷酸酶作用下转化为卡泊三醇(CAL)，CAL进而诱导PSCs静息，增效DOX的抗肿瘤功效。最终，MR-T-PD在BxPC-3/HPaSteC肿瘤球以及体内模型中显示出高效的PSCs静息能力和细胞凋亡诱导能力。

溶酶体中存在大量的组织蛋白酶B，Li等[50]利用组织蛋白酶B敏感性二肽接头缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)将胆固醇与短肽(HHHKKHHHKK)相偶联，继而荷载干扰胶原合成的siPCBP2，开发了一种组织蛋白酶B敏感型纳米复合体cholesterol-peptides/PCBP2 siRNA。该纳米复合体能在PSCs溶酶体内响应于组织蛋白酶B的刺激而解聚，快速释放siPCBP2，进而通过高效沉默PCBP2表达来降低胰腺癌基质中I型胶原的沉积，在富含基质的PANC-1/NIH3T3肿瘤球模型中显著增强小分子药物渗透，并在体内模型中成功削弱肿瘤基质并提升吉西他滨的疗效。

4 总结与展望

PCAFs靶向调控策略已展示出了其在改善抗肿瘤药物递送和增效多种抗胰腺癌疗法方面的巨大潜力。由于PCAFs具有不同的起源、表型及生物学作用，不同机制的PCAFs调控药物可能会使胰腺癌TME发生不同的改变，因此在靶向调控PCAFs时需明确所施用药物的药理机制。除直接靶向调控PCAFs外，针对PCAFs与胰腺癌TME中其他组分之间串扰的调控策略也应受到充分的关注。此外，针对PCAFs靶向调控的药物递送策略仍具有较大的优化空间：应充分考虑胰腺癌的生理病理特性，尽可能地克服药物的瘤内蓄积、摄取和释放障碍；PCAFs的表型多样性和可塑性对其靶向调控药物的精确时空递送具有更高的要求。