免疫细胞对肠干细胞命运调控的最新研究进展

宋丽娟，王昀

(中国药科大学药物科学研究院,江苏 南京 211198)

肠上皮与食物抗原、化学物质和共生微生物直接接触，因此肠上皮屏障完整性与宿主健康状况息息相关[1]。肠道内不同位置含有多种先天免疫和适应性免疫细胞，包括B细胞、T细胞、先天性淋巴细胞(innate lymphocyte cells，ILCs)、树突状细胞(dendritic cells，DCs)、巨噬细胞和肥大细胞，共同维持肠道上皮屏障稳态[2]。肠道上皮屏障稳态的破坏会导致多种肠道或者肠外疾病，例如炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)、结直肠癌、心血管疾病和多种神经退行性疾病[3-6]。

肠上皮细胞处于快速更新状态，约3～5 d更新一次[7]。肠上皮细胞的快速更新依赖于肠隐窝底部表达富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5，LGR5)的肠道干细胞[8](intestinal stem cells，ISCs)。ISCs可以不断地进行自我更新，产生的快速增殖细胞(transit amplifying cells，TA cells)沿着隐窝不断向上移动，逐渐分化为所有类型的肠上皮细胞[9]。

ISCs生态位提供了维持ISCs自我更新和分化所需的微环境。生态位中多种细胞提供的分子信号网络调控，在维持正常的肠上皮细胞更新外，还可阻止肿瘤的发生[10]。以往研究发现，基质细胞和潘氏细胞(Paneth cells，PCs)提供复杂的旁分泌信号，包括Wnt、Notch、BMP和Hedgehog信号，共同维持ISCs稳态。近年来，随着类器官培养技术和单细胞测序技术的不断发展，更多的数据证明了肠道内免疫细胞除释放细胞因子介导免疫反应外，也作为ISCs生态位的成员调控ISCs的命运——维持正常生理条件下肠上皮屏障稳态和组织修复中肠上皮细胞的再生，但具体机制仍不清楚[11-12]。因此，阐明ISCs生态位中免疫细胞的特性、调控因子及其信号网络，对了解肠上皮稳态的维持和肠损伤后的修复至关重要。本文综述了肠道内免疫细胞(T细胞、ILCs、巨噬细胞和DCs)对于ISCs命运调控的最新进展，以期更好地理解肠道生理，为肠上皮屏障疾病的治疗提供参考。

1 肠干细胞

Cheng等[13]在19世纪70年代使用电子显微镜发现在隐窝底部的PCs中穿插着更为瘦长的细胞，这些细胞被他们称为隐窝基底柱状细胞(crypt-base columnar cells,CBCs)。并通过化学放射标记进行谱系追踪，Cheng等[13]证明CBCs可以分化成为4种不同类型的肠上皮细胞，这是ISCs的首次提出。ISCs的特异分子标记对于识别和研究具有至关重要的意义，但受限于当时的技术，未能鉴定出特异性标志物。随着单细胞测序和小鼠谱系追踪模型的逐渐成熟，2007年Barker等[8]鉴定出了Lgr5作为CBCs的特异性标志物，并且通过Lgr5敲入小鼠进行谱系追踪，证明了CBCs确实处在不断的自我更新中，且可以分化成为4种不同的细胞，进一步验证了Cheng和Leblond的发现。其他新发现的肠上皮细胞类型，如Tuft细胞和M细胞，也同样被证明来自LGR5+CBCs[14-15]。且从小鼠体内分离出的单个Lgr5+CBC可以在体外生成包含所有肠上皮细胞类型的肠类器官。肠类器官维持自我更新能力的同时，也形成类隐窝-绒毛的结构，进一步证明Lgr5是CBCs的特异性标记[16]。Lgr5与其配体R-spondin结合，可激活经典的WNT/β-catenin信号通路，对CBCs的自我更新起到至关重要的作用[17]。

但缺失Lgr5+CBCs的小鼠肠上皮稳态未见显著变化，提示肠道内存在其他类型的ISCs[18]。实验证明，在隐窝的+4位置存在Bmi1+的储备干细胞，在CBCs缺失或肠道辐射损伤后的修复过程中起到至关重要的作用。转录组学和谱系追踪证明位于“+4”储备干细胞与Lgr5+CBCs虽都属于ISCs，但对WNT和辐射损伤存在不同的敏感性，Lgr5+CBCs对WNT信号存在更强的响应，而对辐射损伤敏感[19]。但是肠道损伤后的再生修复又依赖于CBCs，因此储备干细胞的动员和不同类型ISCs间的相互转换，甚至部分上皮祖细胞去分化重新获得干性的过程可能是肠道损伤后修复的关键。但总体而言，这些干细胞都处于隐窝内，均受到干细胞生态位信号的调节。

2 肠干细胞生态位

肠干细胞生态位是维持ISCs自我更新和增殖能力的微环境，包含多种分泌局部信号的细胞，在形成有效的肠上皮屏障和细胞过度生长的信号间维持平衡[20]。这些细胞既可以是上皮细胞，例如PCs，又可以是非上皮细胞，如间充质细胞，包括肌成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞，也包括免疫细胞和神经元。肠干细胞生态位内经典的调控通路包括Wnt、Notch、BMP和Hippo/YAP等信号，此外，饮食、炎症、微生物及其代谢产物，例如次生脂肪酸和短链脂肪酸，也可对ISCs命运进行调控[10]。

潘氏细胞(Paneth cells，PCs)位于小肠隐窝底部，与ISCs交错排列，提示PCs对ISCs可能存在直接调控作用[21]。PCs表达大量的EGF、Wnt3和DLL4以维持干细胞功能。在体外类器官的培养中，仅用ISCs生成的类器官数量很少，但是向培养体系中加入PCs后，类器官的形成能力大幅增加。并且外源性Wnt3的加入可达到与PCs类似的效果，提示PCs可能主要通过分泌Wnt配体以维持干细胞功能[21]。但是在小鼠中去除PCs却不影响小鼠隐窝结构和Lgr5+ISCs的数量和功能，提示PCs并不是维持小肠ISCs功能的唯一细胞[22]。结肠组织中虽然没有PCs，但是存在深隐窝分泌细胞，其在结肠干细胞生态位中被普遍认为发挥着类似PCs的调节作用[23]。

肠干细胞生态位中的间充质细胞，包括成纤维细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，为ISCs提供结构支持以外，也被认为是Wnt配体的主要来源。缺失Foxl1+或Gli1+的间充质细胞会导致Wnt信号缺失进而导致ISCs功能异常，最终导致肠道衰竭[24-25]。

3 免疫细胞对肠干细胞的调控

肠上皮屏障中含有多种免疫细胞，包括固有免疫和适应性免疫细胞，其是肠黏膜免疫系统的重要组成部分。以往研究很大程度上集中于黏膜免疫系统在病原体防御和肠道炎症中的作用。随着体外肠道类器官培养和单细胞测序技术的发展，ISCs和免疫细胞之间的调控关系被逐步揭示，许多细胞因子已被证明对ISCs命运具有调控作用[12]。最近研究表明，免疫细胞及其分泌的细胞因子与ISCs命运、肠道的发育和肠损伤后的修复再生有关。

3.1 T细胞 胃肠道是造血干细胞移植的首要受累器官，供体的T细胞攻击受体的肠上皮细胞，造成ISCs和PCs数量的显著减少，引起严重的移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)。供体T细胞表面的α4β7受体与血管内皮表达的MAdCAM-1结合，直接靶向肠隐窝位置并释放IFN-γ促进ISCs死亡，且该过程早于PCs的缺失，但绒毛区域浸润的供体T细胞数量很少[26]。小鼠骨髓移植模型也证明供体T细胞的浸润部位与造血干细胞前处理和移植方式无关，提示T细胞可能与ISCs存在独特的亲和力，并存在PCs非依赖的直接调控作用[27]。Chen等[28]采用T细胞和肠道类器官共培养模型进一步证明，T细胞对ISCs命运的调控依赖于细胞间的直接接触，而非分泌的细胞因子。T细胞表达的αEβ7与ISCs或TA细胞表面的E-钙粘素结合，促进E-钙粘素的内吞，激活Wnt信号并抑制Notch信号，维持正常的ISCs稳态。阻断αEβ7与E-钙粘素的结合则会导致ISCs分化缺陷，且该过程可能是TCR类型特异的。因为在β7-/-小鼠隐窝内TCRαβ+T数量明显减少，而TCRγδ+T的数量没有变化，回输WT小鼠的CD4+和CD8+T均可逆转b7-/-小鼠体内ISCs的分化异常。因此T细胞对ISCs命运的调控可能依赖于抗原识别过程。的确，T细胞对ISCs命运的调控也被证明与ISCs表达的MHC分子有关。ISCs同时表达MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子，可向肠固有层递呈腔内抗原诱导免疫耐受[29]。自我更新活跃的ISCs与相对静止的干细胞相比，MHC-Ⅰ分子表达更高，通过抗原递呈并激活CD8+T细胞，从而受到攻击，引起GVHD[30]。肠干细胞中特异性敲除MHC-Ⅱ的小鼠体内ISCs数量增加，且相关干性基因表达上调。同时隐窝处CD4+T细胞浸润明显减少，T细胞激活基因例如Tcf7、Ifng、Ctla4、Tigit等显著上调，而绒毛区域浸润的CD4+T细胞未见明显改变[31]。因此，T细胞对ISCs的调控可能与ISCs的抗原递呈功能相关，但具体机制仍需进一步研究。

在小鼠肠道常驻CD4+T细胞中，Treg在结肠中占25%～35%。IBD患者中循环和炎症部位浸润的Treg数量减少，且减少的程度与疾病的严重程度一致[32]。提示Treg在肠道稳态中起到至关重要的作用。在共培养体系中，iTreg和IL-10促进类器官生长且上调ISCs相关干性基因。然而，在Foxp3-DTR小鼠中，Treg的缺失不仅导致ISCs增殖增加，而且还促进ISCs向Tuft细胞和杯状细胞分化[33]。体内外实验结果的差异可能来自体外Naïve T细胞经TGF-β诱导成Treg与体内Treg细胞存在异质性，也可能是体内复杂的免疫微环境中其他细胞存在间接调控作用。

3.2 先天性淋巴细胞 ILCs是一群在胎儿时期就定植于肠道中，并且表现出显著组织驻留能力的免疫细胞，可帮助胎儿适应出生后富含微生物的环境。根据ILCs产生的细胞因子、表型和发育途径，可将其分为三类：ILC1、ILC2、ILC3[11]。不同亚类的ILCs似乎与肠上皮细胞亚群之间形成了不同的模块，从而支持肠道适应不断改变的宿主环境。ILCs在稳态下即产生不同的细胞因子，其中许多可直接影响上皮细胞的功能，最典型的就是IL-22。IL-22是上皮稳态的关键调节因子，与上皮屏障功能和多种肠道疾病有关[30,34]。ILC3作为小肠中IL-22的主要来源之一，在肠道稳态中也显示出重要的作用。一些研究已经证明ILC3分泌的IL-22可调控ISCs的维持和分化，并对DNA损伤具有保护作用[35]。肠上皮表面经常与基因毒性化合物接触，基因组完整性在很大程度上依赖于DNA损伤反应(DNA damage response，DDR)。十字花科蔬菜中含有的硫代葡萄糖苷的代谢物是常见的基因毒性物质。这些代谢物通过结合ILC3表面的芳香烃受体，促进ILC3释放IL-22，激活ISCs中的STAT3/ATM/γH2AX信号通路，驱动DDR反应，从而促进ISCs的凋亡并诱导细胞周期阻滞，减轻硫代葡萄糖苷的基因毒作用[36]。但另一项研究发现，在甲氨蝶呤诱导的肠损伤模型中，小鼠体内IL-22信号的缺失虽然影响ISCs的数量，但肠上皮结构正常，不会加重甲氨蝶呤诱导的肠损伤。该效应与缺失ILC3的小鼠一致，证明ILC3通过IL-22信号维持ISCs的数量。但是缺失ILC3的小鼠体内ISCs的增殖能力明显下调，进一步研究表明ILC3通过GP130促进YAP/TEAD结合后的核转位，从而调控ISCs的增殖和分化，促进损伤后的修复。使用PP2阻断YAP1/TEAD的结合则会抑制ILC3对ISCs的调控，此过程并不依赖于IL-22信号[37]。因此ILC3对于ISCs的维持和再生存在不同的调控途径。与之一致的是， Zwarycz等[38]使用IL-22处理肠道类器官，发现ISCs干性基因表达下调且类器官形成能力显著下降，但是类器官的体积显著增加。作者进一步通过分析IL-22RA1的表达，发现其在TA细胞中表达量最高。高表达IL-22的转基因小鼠试验证明，IL-22促进TA细胞增殖而不促进ISCs增殖。进一步提示IL-22在ISCs和TA细胞之间具有不同的调控作用。IL-22也可作用于肠干细胞生态位中的其他细胞起到间接调控作用。额外给予IL-22或ISCs特异性敲除IL-22的小鼠体内未见PCs数量的改变，但是PCs特异性敲除IL-22RA1后，抗菌肽的分泌显著减少。此外IL-22信号负调控WNT配体的分泌，缺失IL-22会导致WNT6和WNT9表达增加，但是尽管WNT配体表达水平增加，Lgr5+ISCs增殖及其标志物未见明显上调。有趣的是，PCs特异性敲除IL-22RA1小鼠的肠道类器官在单独使用WNT3和DLL4刺激下未见显著的促生长作用，但在IL-22重组蛋白存在下，WNT3和DLL4显著刺激类器官生长[39]。证明IL-22与WNT和Notch信号通路存在复杂的调控机制。总之，IL-22既可直接调控ISCs，也可作用于肠干细胞生态位中其他细胞起到间接调控作用。

ILC2和ILC1也对ISCs存在重要调控作用。ILC2分泌IL-13，结合IL-13R磷酸化下游STAT6，从而激活WNT/β-catenin信号通路促进ISCs的自我更新。该过程受到非编码RNA的调控。circ-PAN3和KSRP通过竞争性结合mRNA以调节IL-13R的稳定性，进而调节ISCs的增殖[40]。并且ILC2通过IL-13与Tuft细胞形成调控环路。蠕虫感染后，Tuft细胞分泌的IL-25进一步激活ILC2分泌IL-13，IL-13反过来作用于ISCs促进其向Tuft细胞和杯状细胞的分化，以清除蠕虫感染[41]。ILC1表达IFN-γ来清除细胞内病原体，并在IBD患者的炎症部位富集，但是ILC1与上皮细胞亚群的特异性相互作用仍缺乏研究。一项研究使用ILC1和小肠类器官共培养发现，ILC1促进小肠类器官的增殖，通过分泌TGF-β1诱导p38γ的磷酸化，激活β-catenin并与CD44v6形成正反馈环路从而促进肠上皮增殖[42]。但ILC2和ILC1对肠干细胞生态位的调节仍不明确。

3.3 巨噬细胞 巨噬细胞也存在于肠道固有层，有助于先天免疫，从而维持肠道内环境稳定。肠道类器官与巨噬细胞共培养体系的成功建立也已成功证明巨噬细胞对ISCs的调控。巨噬细胞对ISCs的调控作用依赖于其分泌的不同细胞因子，如IL-6、IL-8、IFN-γ和TGF-β1已被证明有助于巨噬细胞促进肠道上皮细胞成熟和物理屏障增厚[43]。正常生理状态下，巨噬细胞即分布于隐窝区域，细胞外基质中的透明质酸激活巨噬细胞的TLR4，促进巨噬细胞分泌PGE2，反式激活ISCs中的EGFR信号，促进ISCs增殖和隐窝分裂，促进生命早期肠道的延长。并且在该研究中，氯磷酸酯耗尽巨噬细胞后，ISCs的增殖显著下降，但未发现SOX9+的储备干细胞的增加[44]。而在另一项使用成年小鼠的研究中，长期给予小鼠CSF1R抗体耗尽巨噬细胞后，Lgr5+ISCs的数量显著减少且增殖下降，但是SOX9+Bmi1+的储备干细胞增殖增加。这可能反映了在新生小鼠和成年小鼠体内不同的调控效应。该研究还显示，巨噬细胞的缺失不影响PCs的数量，但是减少Wnt3和Wnt3a的表达。且体外培养肠类器官发现CSF1R缺失不影响ISCs和PCs的数量及标志物的表达，证明巨噬细胞在体内的作用可完全被类器官培养基所替代。进一步微阵列分析研究证明小肠巨噬细胞特异性表达Wnt4和R-spondin，维持ISCs的稳态。提示CSF1R依赖的巨噬细胞对ISCs的调控可能依赖于WNT信号通路[45]。同样的，Saha等[46]的研究证明，巨噬细胞释放的含有WNT配体的囊泡是辐射肠损伤后ISCs活性维持及组织损伤后修复的关键。

巨噬细胞还介导间充质干细胞对ISCs的调控。间充质干细胞(mesenchymal stromal cells，MSCs)已被证明可以缓解IBD，部分可能由于MSCs可以归巢于受损组织并原位分化为功能细胞以替代受损细胞[47]。然而，移植的MSCs仅有部分细胞在体内存活并且迁移到受伤的组织中。提示MSCs介导的治疗效果可能更大程度上与其分泌途径有关[48]。事实上，MSCs的无细胞条件培养基和MSCs的分泌组(包含细胞外囊泡和外泌体)在各种疾病中呈现有益的作用。但是MSCs分泌组中的有效组成成分和作用机制仍不明确[49]。Liu等[50]证明MSCs外泌体的抗炎和免疫调节机制部分依赖于炎症部位的巨噬细胞。作者发现MSCs外泌体在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中被巨噬细胞吞噬，诱导巨噬细胞向M2型极化，下调IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，但上调IL-10的表达，增强对CD4+T细胞的抑制能力。进一步机制研究发现MSCs外泌体中的金属硫蛋白-2通过抑制巨噬细胞中的NF-κB通路，促进其向M2极化。

3.4 树突状细胞 DCs作为肠道中的专职抗原递呈细胞，负责递呈抗原，这对肠道免疫激活和免疫耐受的诱导至关重要。肠上皮细胞与DCs之间存在密切的联系，DCs对上皮细胞的调控目前已经报道。Jones等[51]证明骨髓来源的树突状细胞释放的细胞因子可以通过NF-κB信号通路调节肠道屏障完整性、肠道细胞增殖和细胞死亡。IL-36已被证明可以促进DSS诱导的结肠炎中组织修复，且该效应依赖于分泌IL-23的CD11b+CD103+DCs[52]。此外一项研究表明，缺失肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(tumor necrosis factor alpha-induced protein 3，TNFAIP3)的BMDCs与小肠类器官共培养，发现TNFAIP3的缺失会显著上调小肠类器官的Reg3β和Reg3γ的表达。在DCs特异性敲除TNFAIP3小鼠体内也发现PCs效应蛋白Reg3β、Reg3γ、溶菌酶和Pla2g2的表达显著上调[53]。因此DCs对PCs的成熟可能存在直接调控，但是DCs在肠干细胞生态位中的作用仍缺乏研究。

4 结语

尽管这些研究初步揭示了免疫细胞对ISCs命运的调控，但是肠干细胞生态位中存在多种细胞，除免疫细胞对ISCs的直接调控外，免疫细胞之间、免疫细胞与上皮细胞和免疫细胞与基质细胞之间可能存在更加复杂的调控网络。最新研究也表明ISCs和ISCs生态位内的细胞均存在异质性[54-55]，且ISCs分化成为成熟的肠上皮细胞可能不经过经典的分化路径[56]。这些发现都可能导致研究结果的差异。

免疫细胞不仅调控感染和损伤的急性反应和损伤后修复过程，且在正常肠道发育和生理稳态的维持中也很重要。因此进一步研究免疫细胞对ISCs的调控机制，可以为炎症性肠病的发生和治疗提供新的思路。