骨免疫微环境在种植体骨结合中的作用

袁 影，黄天宇，王浩辰，宫 苹，向 琳

第4次中国口腔健康流行病学调查报告显示，我国中老年人群牙周健康和口腔卫生状况较差，牙周病、牙缺失发病率高，严重影响患者的生活质量[1]。种植义齿因其美观、咀嚼效率高，是目前临床牙缺失修复的主要方式之一。种植技术成功的核心在于骨结合(osseointegration)，即骨组织与种植体的形态与功能的结合[2]。传统的骨结合研究侧重于观察成骨、破骨反应；近年来，骨免疫学的发展揭示了宿主的免疫响应在调节骨骼动力学方面的重要作用，中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、T细胞、B细胞等免疫细胞及相关信号通路参与了骨改建、骨吸收及炎症反应等，并且受到各种因素的影响[3]。研究提出：骨结合不仅是单纯的成骨反应，还是由免疫驱动的种植体周的新骨形成反应[4]。钛种植体植入后1～4周，组织定量分析和组织学研究观察到许多免疫和炎症相关标志物表达变化，表明免疫应答密切参与骨结合的形成[5]。良好的免疫微环境可以促进组织的愈合和再生，从而达到更理想的骨结合效果，不良的免疫反应可导致慢性炎症，进而导致骨结合失败。本文旨在回顾并重点阐述种植体植入后，骨免疫调节在骨结合形成及维持中的作用。

1 种植体植入后的早期免疫应答

种植体植入骨组织后，血液和组织液的蛋白质黏附于种植体上，随后因子Ⅻ活化产生凝血酶，凝血反应和补体系统被激活，补体C3a和C5a释放，植入术后2 h即可形成包含红细胞、中性粒细胞、单核/巨噬细胞的血凝块，多形核白细胞(polymorphonuclear leukocytes，PMNs)被招募和激活。PMNs与种植体表面的蛋白质层相互作用，在与整合素和模式识别受体结合后，触发PMNs的吞噬反应。PMNs通过释放蛋白水解酶和活性氧类(reactive oxygen species，ROS)吞噬微生物、侵蚀材料表面，并于24～48 h内迅速消耗、凋亡[6]。活化的PMNs可以通过分泌白细胞介素(interleukin，IL)-8招募新的PMNs，也可以通过分泌单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和巨噬细胞炎症蛋白-1b(macrophage inflammatory protein-1b，MIP-1b)，抑制自分泌功能，募集单核细胞和巨噬细胞，转为慢性免疫应答，这一过程可能持续数周[7]。急性免疫应答时间取决于植入的生物材料种类及创口大小，通常为几小时至几天，如植入1周后骨-种植体界面仍大量存在PMNs，则提示种植体周存在感染[8]。

2 单核巨噬细胞介导的慢性免疫应答

PMNs招募的单核/巨噬细胞是慢性免疫反应的主要成分，并使免疫应答延长[9]。单核细胞聚集至种植体周，分化为巨噬细胞，分泌促炎物质，并吸引更多的免疫细胞。目前多数研究认为，巨噬细胞作为先天免疫反应中的关键细胞，在创伤位点的微环境调控中起到了重要的作用。20世纪90年代，Stein等[10]提出巨噬细胞有经典(classically)和替代(alternatively)两种极化方式。经典途径激活的巨噬细胞称为M1，由干扰素(interferon，IFN)-γ、NK细胞或抗原提呈细胞分泌的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、Toll样受体配体如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等激活，分泌TNF、IL-1、IL-6等促炎因子，是宿主防御反应的重要组成部分；替代途径激活的巨噬细胞称为M2，由IL-4和IL-13等激活，高表达精氨酸酶Ⅰ(arginase 1，Arg1)，分泌IL-4、IL-10等抗炎因子，促进炎症吸收，有利于创伤愈合及组织改建[11]。

巨噬细胞作为组织中最具多样性的免疫细胞之一，已有文献报道其具有极化的更多亚型及分类模式，细胞追踪、单细胞测序等检测发现，在体内大多数情况下，巨噬细胞常在不同瞬间接触多种信号，可同时显示M1和M2特征表型，并沿巨噬细胞极化谱以中间状态存在[12-13]。不同表型的巨噬细胞对种植体周成骨有着不同的作用。M1型巨噬细胞分泌促炎因子，加剧种植体植入后因炎症造成的组织损伤，也有研究报道M1巨噬细胞可以促进骨的愈合，表现出一定的两重性[14]。M2型巨噬细胞分泌的IL-4可显著增加新生骨中矿化结节的含量，IL-10也可增强间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)对骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein，BMP2)及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的表达，而阻断IL-10的分泌则会抑制后续骨基质的矿化[15]。因此，种植体植入后，M1巨噬细胞如能及时转换为M2巨噬细胞，可以促进新骨形成，加速骨结合[16]。

另一方面，巨噬细胞融合成的多核巨细胞(multinucleated giant cells，MNGCs)可以吞噬细胞碎片且与植入物的纤维包裹有关[17]。MNGCs被认为来源于骨巨噬细胞(osteomacs)，和破骨细胞一样都属于核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)激活的巨噬细胞来源。研究表明MNGCs也可以从M1型极化成M2型，在种植术后多年仍存在于种植位点的骨组织中，且与周围组织的血管生成有关[18]。但由于MNGCs的标志物等仍存在争议，其在种植体骨结合中的作用仍有待进一步阐明。巨噬细胞及其分化细胞在种植体周的免疫反应调节中起到重要而复杂的作用，值得进一步深入研究。

口腔环境较为复杂，种植体可长期接触抗原如食物、细菌、真菌及其产物，种植体周组织具有较强的免疫反应活性。研究发现，树突状细胞同样也是骨免疫中的重要效应细胞，可以通过RANKL激活破骨，促进骨吸收[19]。树突状细胞作为抗原提呈细胞，通过主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)识别抗原，引发淋巴细胞的抗原特异性免疫反应[20]。研究发现，金属离子也可以作为抗原与MHC等相互作用，诱导免疫反应。游离的钛离子可以与血清蛋白结合，形成半抗原复合物，激活Th1免疫应答[21]。此外，钴合金颗粒可以诱导核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的活化，通过toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)促进肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)和IL-8的释放[22]。钴、ZrO2、TiO2、SiO2的纳米颗粒也可以调节人巨噬细胞的炎症反应[23]。此外，在无菌性松动的种植体周检测到金属离子和促炎细胞因子IL-1β、IL-2、IL-8、IFN-γ和TNF-α的上调[24]。上述研究表明，树突状细胞和巨噬细胞是种植体周免疫应答的哨兵，而树突状细胞诱导的适应性免疫应答在种植体骨结合中的作用仍待阐明。

3 宿主免疫应答的调节因素

种植义齿由骨内种植体、基台及上部修复体组成，受口腔环境、修复方式及咀嚼功能等多种因素影响，如咬合、牙周微生物、修复材料等[25]。同时，IL-1β等细胞因子的遗传多态性、患者吸烟和饮酒的习惯、肥胖、糖尿病、某些疾病的药物摄入也会影响宿主的免疫响应。要达到长期稳定的功能性骨结合，骨相关细胞、免疫细胞和植入物表面之间的相互作用至关重要。种植体植入后，骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)被募集至种植体周，成骨向分化形成新骨；同时，BMSCs也可以上调巨噬细胞的CD206表达，使IL-10、IL-12的分泌增加，TNF-α、IL-6、IL-12分泌减少，并抑制LPS刺激的巨噬细胞CD86和MHC-Ⅱ类分子的上调，减弱对抗原特异性CD4+T细胞的激活，增强巨噬细胞的吞噬作用，并使其M2型转化[26]。体内研究表明，在种植体植入后，BMSCs可诱导巨噬细胞，并通过分泌前列腺素E2使其从M1型转换为M2型，招募内皮细胞和骨髓中的骨祖细胞，形成利于骨再生的微环境[27]。

种植体的表面形貌和表面修饰也可以调节宿主的免疫应答。研究发现亲水表面的种植体可以调节巨噬细胞，通过分泌抗炎因子，形成了更好的骨结合[28]。相较于光滑表面，粗糙亲水表面能促进转化生长因子-β1、BMP2、IL-1β、IL-6等因子的表达，并通过ERK1/2等通路调节巨噬细胞的形态及极化，促进成骨[29-30]。种植体表面的纳米形貌不仅可以直接调节骨细胞，还可以调节免疫细胞[31]。最新研究表明：微纳米孔形貌的钛表面可以刺激Raw264.7细胞M2极化，形成促修复的免疫微环境，并促进成骨细胞的增殖和分化，调控成骨细胞的自噬，进一步调节成骨[32]。钛经阳极氧化处理后，表面纳米管的管径会影响巨噬细胞的极化，促进M1型巨噬细胞尽早向M2型转化[33]。此外，钛表面的纳米结构也可以负载治疗药物、促成骨因子、抗炎因子等，有望通过局部药物释放，为炎症、感染、骨结合不良提供新的治疗方法[34]。在种植体表面修饰氧化石墨烯/IL-4涂层也可以调节种植体周组织的M1/M2比例，进而促进种植体骨结合[35]。通过钛纳米管，可实现地塞米松及抗生素的加载和控释，并促进成骨[36]。阳极氧化技术形成的二氧化钛纳米胶囊也可以作为吲哚美辛等药物传递的纳米载体，用于各种靶向和局部给药，对骨组织的免疫反应进行调节，但纳米结构的长期机械稳定性需进一步研究[37-38]。但相关研究均以巨噬细胞为主，对其他免疫细胞的调节报道较少。不同的骨诱导技术对调节免疫细胞反应的影响及可能的潜在机制是目前的研究热点之一。

4 小 结

本文回顾了种植体植入后的免疫响应过程。关于种植体骨结合的研究，过去多聚焦于如何促进BMSCs及成骨细胞的增殖、分化以及成骨细胞与破骨细胞的平衡。骨免疫研究的不断深入，揭示了种植体和骨生物材料与免疫系统相互作用，但骨巨噬细胞、MNGCs、树突状细胞在骨结合中的作用及机制仍有待进一步阐明。如能确定对于骨再生和骨结合有利的免疫环境及其关键调节靶点，进而通过种植体表面改性或药物干预调控免疫微环境，促进种植体植入后骨结合的形成和维持，将有望为临床实现更好的种植治疗提供新思路。