Nrf2/HO-1信号通路在急性肺损伤中的研究进展

孔凯文,孟 岩综述，邓小明审校

0 引 言

急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS)是由于肺泡-毛细血管屏障通透性增加导致的双侧肺水肿和低氧血症的急性发作，因高死亡率和缺乏有效的治疗药物一直备受关注[1]。ALI/ARDS的发病机制尚未完全了解，目前认为氧化应激和剧烈的炎症反应在ALI/ARDS进展种扮演着重要角色[2]。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2)是细胞内一种重要的转录因子，被激活后可促进抗氧化酶和解毒酶的表达，在维持氧化还原稳态、代谢平衡和蛋白质稳态中起关键作用[3]。血红素加氧酶1(heme oxygenase，HO-1)是Nrf2的其中一个下游，是血红素代谢过程的限速酶，具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等多种作用[4]。最近的研究发现，Nrf2/HO-1信号通路在ALI/ARDS中能够减轻炎症反应和氧化应激损伤，抑制细胞焦亡和铁死亡，进而减轻肺损伤。本文就Nrf2/HO-1信号通路在ALI/ARDS的研究进展作一综述，以期为ALI/ARDS的治疗和特效药物的研发提供新的思路。

1 ALI/ARDS的定义

1967年，Ashbaugh等[5]通过一份病例报告对ARDS进行了初步描述，这份病例报告描述了成人危重症患者出现急性低氧血症、非心源性肺水肿、肺顺应性降低、呼吸做功增加以及需要正压通气等临床症状，这些症状的出现与一些临床疾病相关，如胸部外伤、肺炎、脓毒症和误吸等。在这之后提出并使用了多种定义，直至1994年,美国-欧洲共识会议(the American-European Consensus Conference，AECC)的定义发表。AECC将ARDS定义为急性低氧血症(PaO2/FIO2≤ 200 mmHg)，后前位胸片示双侧肺浸润影，临床无左心房高压的证据；AECC还引入了急性肺损伤(acute lung injury，ALI)的概念，采用的标准和ARDS类似，但低氧血症相对较轻(PaO2/FIO2≤ 300 mmHg)[6]。2012年欧洲重症医学年会对这一定义进行了更新，制定了柏林定义，根据氧合水平，将ARDS分为轻度(200 mmHg

2 ALI/ARDS的病因和发病机制

ALI/ARDS的常见病因和危险因素分为两种：①直接因素，肺炎(细菌和病毒，真菌较少见)、胃内容物误吸和外伤(如肺挫伤)、缺血-再灌注损伤(体外循环和肺切除术后)、呼吸机相关性肺损伤、溺水(误吸海水或淡水)以及吸入烟雾或有毒气体等；②间接因素，由其他系统性疾病所致的肺损伤，如非肺源性脓毒症、急性胰腺炎、输血相关急性肺损伤以及失血性休克等[2]。

目前ALI/ARDS的病理机制尚未完全了解，但已有研究证明氧化应激和炎症反应在ALI/ARDS的病理过程中扮演着十分重要的角色。各种损伤性刺激，如细菌、病毒、高氧、胃内容物误吸以及呼吸机相关性肺损伤等均会直接破坏肺组织，同时诱导炎症反应，从而对肺组织造成二次损伤。首先，损伤性刺激会激活Ⅱ型肺泡上皮细胞和肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages，AMs)表面的Toll样受体，诱导趋化因子的分泌，从而将循环中的免疫细胞募集到肺泡内[8]。中性粒细胞迁移穿过肺泡上皮后，释放毒性介质，包括蛋白酶、活性氧(reactive oxygen species，ROS)以及中性粒细胞胞外杀菌网络(neutrophil extracellular traps，NETs)[9]。中性粒细胞在宿主免疫反应中扮演着重要角色，但其释放的毒性介质同时损伤了肺泡毛细血管内皮和肺泡上皮。肺泡上皮损伤还包括肺泡上皮细胞质膜的损伤，这可能是细菌释放的成孔毒素、高氧和机械拉伸等引起的[10]。此外，血管内皮钙粘蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)的稳定性降低，肺泡毛细血管通透性增加[11]。这会导致大量红细胞渗出并释放出血红蛋白，血红蛋白分解后引起肺泡内游离血红素水平增加，加剧氧化应激损伤[12]。总之，以上因素综合作用增加了肺泡-毛细血管屏障的通透性，进一步促进了炎性细胞的迁移，同时更多富含蛋白质的水肿液流入肺泡腔，显著影响了气体交换，最终导致患者低氧血症，需要机械通气。随着病程进展，肺泡毛细血管损伤和肺间质水肿逐渐加重，CO2排出能力下降，从而引发高碳酸血症，这也是ALI/ARDS患者肺死腔增加的原因[13]。此外，ALI/ARDS期间，许多内源性修复机制也受到了特异性抑制。例如低氧血症、高碳酸血症和流感病毒等其他因素会下调钠离子通道和/或下调Na+/K+-ATP酶的活性，导致ALI/ARDS患者的肺泡液清除功能受损[14]。高碳酸血症还会抑制肺泡上皮细胞的增殖，影响肺组织的自我修复[15]。

3 Nrf2/HO-1信号通路的活化

Nrf2/HO-1信号通路活化的关键是提高Nrf2的活性，这取决于其蛋白质水平，因此通过调控Nrf2蛋白的合成和降解过程可改变其活性。在正常生理状态下，Nrf2存在于细胞质中，Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)分别与Nrf2的DLG模体和ETGE模体结合，其中与ETGE模体的亲和性较高，而与DLG模体的亲和性较低[16]。Cullin 3(CUL3)以支架蛋白的形式与Keap1的BTB结构域结合共同形成E3泛素连接酶复合体，然后该复合体通过Keap1特异性识别Nrf2并介导其泛素化，泛素化后的Nrf2被26S蛋白酶体降解[17]。这种降解机制使得细胞质中的Nrf2蛋白维持在一个较低的水平，确保只有一小部分新合成的Nrf2可到达细胞核以调节靶基因的基础表达。当外界刺激存在时，如ROS、亲电子试剂和来自三羧酸循环以及糖酵解过程的中间代谢产物等，可迅速对Keap1内的半胱氨酸残基进行氧化修饰，以解除其对Nrf2的抑制作用[18]。先前认为Keap1与DLG 模体结合的丧失是Nrf2蛋白稳定性和氧化应激期间水平增加的主要途径，但最近一项关于蛋白质-蛋白质相互作用的研究表明，亲电子试剂不影响Keap1与Nrf2的DLG模体或ETGE模体的结合[19]。Keap1内半胱氨酸残基的氧化使其无法招募E3连接酶进行Nrf2的泛素化，Nrf2的半衰期随之延长，在细胞质种逐渐蓄积。此外，自噬蛋白p62是解除Keap1对Nrf2的抑制作用的另一个机制。p62通常会标记受损的蛋白质或细胞器以供自噬体识别，然后在溶酶体中进行降解。p62蛋白中的STGE模体与Nrf2的ETGE模体结构相似，也可与Keap1结合[20]。PI3K-Akt-mTOR信号通路的激活会诱发STGE模体中Ser349的磷酸化，使p62与Keap1结合得更紧密，然后通过自噬增加Keap1的降解[21]。因此，自噬过程常常伴随着Nrf2蛋白的积累。

Nrf2在细胞质中蓄积后进入细胞核，与小Maf蛋白形成异二聚体，然后共同与靶基因启动子区域的抗氧化反应元件(antioxidant response elements，ARE)结合[22]。在许多抗氧化基因和解毒基因的启动子区域中都包含ARE，均可被Nrf2激活后，因此Nrf2在保护细胞免受外界刺激损伤的过程中扮演在重要角色。HO-1是Nrf2的其中一个下游，作为一种应激蛋白和代谢酶，参与调节细胞稳态、免疫防御以及炎症反应，在多种急性器官损伤中发挥保护作用。近来的研究表明，ALI/ARDS患者的肺泡内血红蛋白和游离血红素的水平显著增高，加剧了氧化应激损伤和Toll样受体激活后引发的炎症反应[12]。HO-1是血红素降解过程的限速酶，能够催化血红素降解为胆绿素(biliverdin，BV)、Fe2+和一氧化碳(carbon monoxide，CO)[4]。然后，BV在胆绿素还原酶的作用下转化为胆红素(bilirubin，BR)，BV和BR均有很强的抗氧化活性，新的研究还发现BR具有免疫调节作用以及对脂质代谢过程的调控作用[23]。Fe2+具有促氧化作用，但当它合成铁蛋白后具有抗氧化活性，能够发挥细胞保护作用[24]。CO可改善线粒体功能，从而调节下游信号通路，最终产生抗凋亡、抗炎和免疫调节作用[25]。

在正常生理状态下，肺组织内存在一定水平的Nrf2和HO-1，这对维持细胞内稳态十分重要。目前，已有多项研究发现，Nrf2/HO-1信号通路通过清除过量的ROS、抑制细胞因子风暴、铁死亡和细胞焦亡，在多种因素诱发的ALI/ARDS中发挥保护作用。

4 Nrf2/HO-1信号通路在ALI/ARDS中的保护作用

革兰阴性菌感染是诱发ALI/ARDS的重要原因之一，革兰阴性菌外膜的主要成分脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，可引起剧烈的炎症反应。在经气管内注射LPS诱发ALI/ARDS的小鼠模型中，炎症反应在2～4 h内发生，并在24～48 h达到高峰，小鼠肺组织表现为弥漫性肺泡损伤、中性粒细胞浸润和肺水肿[26]。研究发现，Nrf2/HO-1信号通路的激活可以减轻LPS诱发的炎症反应，包括抑制AMs和肺泡上皮细胞释放炎性因子(如IL-6、IL-1β和TNF-α等)，以及减少中性粒细胞的迁移等，从而减轻肺水肿[27]。LPS诱发ALI/ARDS的另一个重要机制是氧化应激，而且ROS的病理性增加还会加剧炎症反应，因此抑制氧化应激是减轻肺损伤的关键。在LPS诱发ALI/ARDS的小鼠模型中，Nrf2/HO-1信号通路被激活后可显著逆转LPS诱发的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的表达减少，同时清除过量生成的ROS，从而减轻氧化应激损伤，减轻肺水肿，促进肺泡-毛细血管屏障的修复[28]。目前，对于Nrf2/HO-1信号通路在ALI/ARDS中发挥抗炎和抗氧化作用的具体机制尚未完全了解，还需要更多的研究对这些机制进行详细阐述。已有研究报道，Nrf2/HO-1信号通路被激活后，能够抑制肺泡上皮细胞中炎性小体NLRP3的活化，进而抑制了其下游caspase1的激活，一方面中断了炎性因子IL-1β和IL-18的成熟和释放，另一方面抑制了GSDMD的裂解，从而减少了细胞焦亡[29]。此外，最近研究发现铁死亡也是ALI/ARDS病程进展的机制之一，而Nrf2/HO-1信号通路的激活可以明显降低肺组织中的Fe2+浓度，提高GSH-Px和谷胱甘肽(glutathione，GSH)的水平和活性，抑制脂质过氧化，从而减少了肺泡上皮细胞铁死亡的发生。

除LPS之外，Nrf2/HO-1信号通路在其它直接因素诱发的ALI/ARDS中也可通过抑制炎症反应和氧化应激来减轻肺损伤。如在葡聚糖凝胶诱导的大鼠肺损伤模型中，Nrf2/HO-1信号通路能够抑制肺泡毛细血管内皮细胞表达黏附分子，包括ICAM-1和VCAM-1，以减少炎性细胞黏附、游走和浸润，以减轻炎症反应和肺水肿[31]。机械通气(mechanical ventilation，MV)是危重患者发生呼吸衰竭常用的救治方法，但MV会在一定程度上加重肺损伤，即呼吸机诱发性肺损伤(ventilator induced lung injury，VILI)。Xu等[32]的研究发现，Nrf2/HO-1信号通路被激活后可减轻VILI中的炎症反应，通过抑制NF-κB的核转位，进而抑制其下游炎性因子的释放，包括TNF-α、IL-1β 和IL-6等。肺缺血/再灌注损伤(lung ischemia/reperfusion injury，LIRI)多发生于肺栓塞、体外循环和肺移植术后，与患者的不良预后相关。研究表明，Nrf2/HO-1信号通路的激活可以有效抑制caspase-1/GSDMD通路引发的巨噬细胞焦亡[33]，同时还能够提高SOD、GSH-PX 和过氧化氢酶等抗氧化酶的水平和活性，以消除反应性自由基，恢复氧化和抗氧化反应之间的平衡[33]。ALI/ARDS也是是海水淹溺最常见的并发症，低温、高渗的海水进入肺内后，破坏肺泡-毛细血管屏障，诱发氧化应激和炎症反应，进而导致低氧血症和肺水肿。有文献报道，在海水淹溺性肺损伤小鼠模型中，使用富马酸二甲酯激活Nrf2后，HO-1的表达随之增加，进而清除了肺内过量生成的ROS，同时抑制了脂质过氧化，肺泡上皮细胞铁死亡减少[34]。除发挥抗炎和抗氧化作用外，HO-1还可通过促进细胞再生，在肺损伤的修复期也发挥着重要作用[35]。

此外，在由其他间接因素导致的ALI/ARDS中，Nrf2/HO-1信号通路也发挥着重要的保护作用。Yu等[36]的研究发现在经盲肠结扎术诱发的脓毒症肺损伤小鼠模型中，Nrf2被活化后进入细胞核，促进其下游HO-1的表达，HO-1蛋白水平的增加能够抑制巨噬细胞释放晚期促炎因子HMGB1，以减轻炎症反应。还有研究报道，在急性胰腺炎诱发的ALI/ARDS中，Nrf2/HO-1信号通路被激活后也可通过抑制肺泡上皮细胞种炎性小体NLRP3的活化来减轻炎症反应和肺组织损伤，而使用ML385抑制Nrf2的活性后发现，HO-1的表达减少，肺损伤随之加重[37]。此外，肠缺血/再灌注损伤(intestinal ischemia/reperfusion，II/R)和脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia/reperfusion injury，CI/RI)常常会诱发远端器官损伤，肺损伤最为常见。Dong等[38]研究发现，在Ⅱ/R诱发的急性肺损伤中，与野生型小鼠相比，Nrf2-/-小鼠肺内HO-1的mRNA和蛋白水平降低，膜脂过氧化增加，GSH水平降低，电镜下观察到Ⅱ型肺泡上皮细胞铁死亡增多。由此可看出，在ⅡR诱发的肺损伤中，Nrf2/HO-1信号通路同样可通过抑制铁死亡发挥保护作用。在CI/RI诱发的ALI/ARDS中，Nrf2激活后诱导HO-1的基因转录，可减轻氧化应激损伤，促进氧化还原稳态恢复，从而减轻肺损伤[39]。

5 Nrf2/HO-1信号通路的激活策略

既往研究证明，在ALI/ARDS中，Nrf2/HO-1信号通路被激活后能够发挥抗炎和抗氧化作用，从而减轻肺损伤和肺水肿，改善肺的气体交换功能。目前，已有多项动物实验证明Nrf2/HO-1信号通路是中草药治疗ALI/ARDS的有效靶点。Huang等[27]的研究发现荔枝草提取物salviplenoid A可促进Nrf2的表达和核转位，进而激活Nrf2/HO-1信号通路。和厚朴酚、人参环氧炔醇和大黄素也可激活Nrf2/HO-1信号通路，但其发挥作用的具体机制尚未明确[29-30,37]。此外，促红细胞生成素衍生物螺旋B表面肽、异补骨脂查尔酮和脂氧素受体激动剂BML-111等化合物在ALI/ARDS中也可促进Nrf2/HO-1信号通路的激活[28,31-32]。然而，这些治疗方式目前还只用于实验动物，其发挥作用的具体机制、使用方法以及安全性等问题，还需要大量的研究。

6 结语与展望

ALI/ARDS在危重患者中发病率和死亡率一直居高不下，临床上仍缺乏有效的治疗方法。ALI/ARDS的发病机制尚未完全了解，还需要更多的研究来进行全面的阐述。目前认为炎症反应和氧化应激及其诱发的细胞焦亡和铁死亡是ALI/ARDS的主要特征。Nrf2/HO-1信号通路通过清除过量的ROS、抑制细胞因子风暴、铁死亡和细胞焦亡，在多种因素诱发的ALI/ARDS中发挥保护作用。因此，Nrf2/HO-1信号通路有望成为ALI/ARDS治疗药物研发的新靶点。目前，已有多种中草药被证明可在ALI/ARDS发病过程中激活Nrf2/HO-1信号通路，但仍处于动物实验阶段，其能否用于临床还有很多问题需要研究和讨论。探究减轻炎症反应和氧化应激损伤的方法以恢复肺的气体交换功能仍是未来的研究方向。