动脉粥样硬化的表观遗传调控

陈丽君，高奋

(山西医科大学：1第二临床医学院，2第二医院心血管内科，太原 030001)

动脉粥样硬化是由多种不同因素作用于不同环节所导致的慢性疾病，病因尚未完全确定。随着研究的深入，遗传因素在慢性病中的作用被揭示，其中表观遗传学在慢性疾病发生和发展中的作用逐渐被认识，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA。在动脉粥样硬化发生发展过程中血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)在疾病的早期和晚期发挥着不同的作用。近年来，表观遗传学在VSMCs增殖、转化和迁移的研究中取得了重大进展，但仍处于起步阶段[1]。DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA与动脉粥样硬化之间的关系密切，这三种主要的表观遗传调控通过调节血管平滑肌细胞影响动脉粥样硬化进程，本文将对此进行综述。

1 血管平滑肌细胞与动脉粥样硬化

泡沫细胞形成最早的粥样硬化病变脂质条纹，其中泡沫细胞的来源除了人们公认的巨噬细胞外，大约有二分之一来源于血管平滑肌细胞。VSMCs参与动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄及高血压病等，本文主要阐述VSMCs在动脉粥样硬化中的作用。VSMCs在人体发育的过程中经历了由合成型/增殖型/分泌型(未分化型)向收缩型/成熟型(分化型)的表型转换。

合成型VSMCs主要存在于胚胎中期的生理血管和成熟后的病理血管中，其主要功能是增殖、迁移入内膜以及合成细胞外基质蛋白。形态上类似成纤维细胞，肌丝和结构蛋白含量少，合成细胞器(如粗面内质网、高尔基复合体)含量较多，合成和分泌基质蛋白的能力较强、体积较大，标志物主要有骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、Runt相关转录因子2(recombinant runt related transcription factor 2，Runx2)。收缩型VSMCs主要存在于胚胎后期血管和正常血管中，其增殖、迁移能力差或无，胞体呈梭形或带状，含大量肌丝和结构蛋白，合成细胞器含量较少，合成和分泌基质蛋白的能力较差或无，体积较小，标志物主要有α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle aorta/actin α2，ACTA2)、平滑肌肌动蛋白22α(smooth muscle 22α，SM22α)。

巨噬细胞表型的VSMCs吞噬脂质能力增强，胆固醇逆转运减少，细胞内的脂质沉积明显增多，向泡沫细胞转变的进程加快，并且巨噬细胞表型的VSMCs参与炎症反应，抑制其增殖和合成能力，降低动脉粥样硬化中后期斑块的稳定性。

VSMCs在人体发育过程中，由合成型向收缩型的表型转换是可逆的。在适应性反应中，活化的VSMCs可以适度增殖和迁移，有助于血管壁修复；但是，在病理状态下，血管受损后，在各种炎症因子的刺激下，通过多种信号通路使VSMCs由收缩型向合成型过度转换[2]，细胞的增殖率及细胞外基质的合成和分泌大大增加，促进粥样斑块形成。细胞外基质在斑块纤维帽的形成和完整性的维持中扮演着重要的角色，胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，分泌的胶原蛋白减少，斑块稳定性降低。在VSMCs由收缩型向合成型转化的过程中，细胞的分泌功能下降，胶原蛋白分泌减少，斑块的稳定性下降，因此，VSMCs的表型转化在维持斑块稳定性中发挥着关键的作用。其次，VSMCs发生凋亡、坏死和衰老，也可引起分泌的细胞外基质减少，斑块稳定性降低。而且，斑块钙化也会影响斑块的稳定性，且钙化程度和稳定性呈反比。VSMCs在病理条件刺激下可由收缩表型向成骨表型转化，促进斑块钙化过程。在斑块钙化过程中，VSMCs表达多种成骨转录因子，主要有Runx2，生成多种骨生成相关蛋白，主要有骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein, BMP2)、形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein, BMP 4)及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)。表观遗传通过影响上述转录因子及相关蛋白的表达对 VSMCs成骨表型转化过程进行调节，从而影响斑块的稳定性。

2 表观遗传与血管平滑肌细胞

2.1 组蛋白修饰与血管平滑肌细胞

去分化可增强其生长能力，组蛋白修饰包括组蛋白甲基化、乙酰化及泛素化等。组蛋白H3上的第9个赖氨酸甲基化被抑制后，VSMCs的收缩蛋白表达上调，向收缩表型转换，增殖能力减弱。而关于VSMCs的增殖和迁移，涉及最多的是组蛋白乙酰化，组蛋白乙酰化是组蛋白修饰的一种重要方式。一般情况下，组蛋白的乙酰化有利于DNA与组蛋白八聚体的解离，核小体结构松弛，从而使各种转录因子和协同转录因子能与DNA结合位点特异性结合，激活基因的转录。在细胞核内，组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化过程处于动态平衡，并由组蛋白乙酰化转移酶(histone acetyltransferase, HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)共同调控。HAT将乙酰辅酶A的乙酰基转移到组蛋白氨基末端特定的赖氨酸残基上，HDAC使组蛋白去乙酰化，与带负电荷的DNA紧密结合，染色质致密卷曲，基因的转录受到抑制。

HDAC3是HDAC的一个主要成员。HDAC3通过调节过氧化物酶体增殖物受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)参与VSMCs的增殖和炎症反应。HDAC3可通过减少salusin-β对PPARγ蛋白的抑制，使PPARγ蛋白表达增加，活性增强，从而抑制VSMCs的增殖和炎症反应[3]；还可以通过激活P38MAPK-HDAC3途径，使下游的PPARγ表达减弱，增强了VSMCs的增殖和炎症作用，Subramanian等[4]通过动物实验发现血管紧张素Ⅱ刺激小鼠主动脉血管平滑肌细胞的转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)表达增加，验证了此条路径；此外，WD重复结构域蛋白5(WD-40 repeat-containing protein 5, WDR5)还可以与HDAC3形成复合物的形式增加靶基因NOX1组蛋白修饰对血管平滑肌表型的改变[5]。

新发现HDAC9也发挥着重要作用。HDAC9基因与冠心病的发生具有独立相关性，其表达增加对冠心病的发生具有促进作用[6]；其次，HDAC9可参与动脉粥样硬化中炎症反应过程，刘新锋[7]通过对人冠状动脉平滑肌细胞的培养研究发现HDAC9基因抑制脂多糖诱导的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白细胞介素-8(interleukin-8, IL-8)的分泌，达到抑制炎症反应的目的；此外，HDAC9基因影响VSMCs增殖和凋亡，通过促进脂多糖诱导的冠状动脉平滑肌细胞的凋亡，抑制平滑肌细胞增殖[7]。HDAC包括多种成员，其他成员是否参与了血管平滑肌细胞的表型转换、增殖和迁移仍待进一步研究。

2.2 非编码RNA与血管平滑肌细胞

非编码RNA根据RNA的长度和结构分为微小RNA、环状RNA及长链非编码RNA等，在血管平滑肌细胞的增殖、表型转化、迁移等方面发挥着作用。

2.2.1 微小RNA与血管平滑肌细胞 微小RNA之间通过相互形成作用网及信号通路的方式促进血管平滑肌细胞增殖。miR-92a-3p_R+1和miR-92a-5P促进VSMCs由收缩表型向合成表型转化，沈菊连等[8]通过动物实验发现高表达miR-92a-3p_R+1和miR-92a-5P使氧化低密度脂蛋白(oxidation low-density lipoprotein, ox-LDL)诱导的大鼠VSMCs的ERK1/2磷酸化水平增加，引起VSMCs增殖率增加，SM22α表达下调，使用抑制剂后结果相反；其次，miR-33a促进VSMCs收缩表型向合成表型转化，体外实验[9]表明高表达miR-33a通过介导PI3K/Akt/mTOR通路，引起合成型标志物OPN蛋白表达量高，ACTA2蛋白表达量下降，细胞增殖、迁移能力增强，低表达miR-33a得到的结果与之相反。

也有部分微小RNA抑制血管平滑肌细胞增殖。miR-223-3p促进VSMCs由合成表型向收缩表型转化，通过动物实验证明miR-223-3p阻断STAT3的表达抑制IL-6/STAT3诱导的VSMCs钙化，减少了VSMCs中的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、OPN和Runx2的mRNA表达[10]；miR-181c-5p通过下调非受体蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN4的生物作用使VSMCs增殖率、迁移能力降低[11]，凋亡率增加；miR-449a降低VSMCs的增殖和迁移能力[12]，通过降低上皮锌指转录因子Kruppel样因子4(Kruppel like factor 4, KLF4)的表达抑制VSMCs转化为去分化表型。

微小RNA在VSMCs的钙化过程中也发挥作用。低表达miR-30b促进了VSMCs向成骨表型转化，加速了斑块中VSMCs钙化，周薇等[13]通过对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞体外研究证实低表达miR-30b使高磷刺激下的成骨表型VSMCs主要标志物Runx2表达上调，ALP活性增加；抑制miRNA-103表达，可诱导VSMCs向成骨表型转化，促进高磷下的VSMCs钙化，Runt2表达增加[14]。

2.2.2 环状RNA与血管平滑肌细胞 环状RNA通过调控细胞生长因子、细胞生长周期、信号传导通路及转录因子等调节VSMCs表型转化[15]。环状RNA通过竞争性海绵、信号通路及蛋白结合等方式抑制VSMCs增殖和迁移[16-18]。hsacirc0001402抑制VSMCs增殖，hsacirc0001402海绵竞争性吸附hsa-miR-183-5p而上调CD44和FK506结合蛋白样蛋白(FK506 binding protein like protein, FKBPL)的表达，竞争性吸附hsa-miR-545-3p而上调低密度脂蛋白受体相关蛋白1(low-density lipoprotein receptor related protein 1, LRP1)的表达；低表达环状RNA WDR77通过抑制miR-124/FGF2信号通路使VSMCs增殖率和迁移率降低[16]；circANRIL抑制细胞生长周期、促进细胞凋亡，circANRIL与核糖体RNA(ribosomal RNA, rRNA)竞争核仁蛋白PES1结合，阻碍核糖体成熟，使细胞出现小核仁、核系组织紊乱以及细胞周期相关蛋白p53激活入核；敲除circ RNA TET3可抑制VSMCs迁移，circ RNA TET3可以充当内源性miR-351-5p海绵。

环状RNA促进VSMCs增殖、抑制钙化。Circ-ARFIP2促进VSMCs增殖、迁移和侵袭，circ-ARFIP2通过miR-338-3p通路调控激酶插入结构域受体(kinase insert domain receptor, KDR)的表达[19]；circ-Samd4a抑制VSMCs向成骨表型转化，阻碍钙化的进程[20]，circ-Samd4a通过充当miR-125a-3p和miR-483-5p的海绵来调节钙调蛋白调节蛋白相关蛋白2(calnodulin regulated spectrin-associated protein famiy member 2, CAMSAP2)和细丝蛋白A(filament protein A, FLNA)，抑制VSMCs的成骨表型相关转录因子Runx2和相关蛋白BMP2、BMP4的表达水平。

2.2.3 长链非编码RNA与血管平滑肌细胞 有研究表明长链非编码RNA在VSMCs增殖过程中也发挥着关键作用，并且通过微小RNA和环状RNA共同发挥作用[21，22]。lncRNA ANCR抑制hnRNPA1降解且激活miR-490-3p，从而使VSMCs增殖增加和凋亡减少。LncRNA 00341的敲除抑制了VSMCs的增殖和迁移能力，并且lncRNA 00341通过海绵吸收miR-214促进FOXO4蛋白的表达，该蛋白反馈性地导致lncRNA 00341的转录激活。最终表明，lncRNA 00341/miR-214/FOXO4反馈环促进了VSMCs的增殖和迁移[22]。Bell等[23]通过对人冠状动脉平滑肌细胞进行RNA测序发现了31个未被注释的lncRNA，称为平滑肌和内皮细胞富集的迁移分化相关的长链非编码RNA(smooth muscle and endothelial cell-enriched migration/differentiation associated lncRNAs, SENCR)，低表达SENCR后可以看到平滑肌细胞的收缩标志物表达量降低，合成标志物表达量升高，推测SENCR可抑制VSMCs表型转化。不同长链非编码RNA在VSMCs增殖过程中发挥着不同的作用，其机制待进一步深入的研究。

2.3 DNA甲基化与血管平滑肌细胞

DNA高甲基化影响动脉粥样硬化发育期间VSMCs标记基因的表达，损害VSMCs功能[24]。有研究表明高磷酸盐浓度增加了DNA甲基转移酶的活性，进而导致SM22α启动子区域的甲基化，进而引起SM22α表达的缺失与成骨细胞转录因子Cbfa1表达增加，血管钙化增加[25]。10-11易位酶2(ten-eleven translocation 2,TET2)可以使5-甲基胞嘧啶去甲基化，具有抗动脉粥样硬化和血管保护作用。TET2过表达使VSMCs向收缩型转化，TET2低表达使VSMCs向合成型转化。总之，TET2是调节VSMCs的重要因素，在动脉粥样硬化中起重要作用。而体外研究实验也证明增殖的血管平滑肌细胞5甲基胞嘧啶水平降低, 说明DNA的低甲基化可以促进血管平滑肌细胞增殖。DNMT1通过催化KLF4启动子区域的DNA甲基化而下调KLF4的表达[26]，抑制VSMCs表型转换。不同的DNA甲基化可引起VSMCs的表型转换。

3 表观遗传和其他血管细胞

血管内皮细胞促进脂质点的形成，在动脉粥样硬化的初始阶段发挥关键作用，内皮细胞KLF4启动子的甲基化通过血流紊乱增加，从而抑制KLF4表达,促进内皮细胞炎症作用[27]。miRNA和TET2可调节内皮细胞功能，组蛋白修饰和细胞因子参与内皮细胞基因表达和多种相关调节因子的合成，引起内皮细胞功能紊乱，加速了动脉粥样硬化的起始阶段。巨噬细胞吞噬ox-LDL,转变为泡沫细胞,参与形成早期脂质条纹，组蛋白修饰影响巨噬细胞的吞噬功能，并诱导分化为炎性细胞参与炎性反应；DNA甲基化导致巨噬细胞内的自由基蓄积引起线粒体功能障碍，加重动脉粥样硬化；非编码RNA调节巨噬细胞的表型和炎性反应。

4 小结和展望

综上，VSMCs对粥样斑块的形成、稳定性和钙化发挥着关键的作用。表观遗传学因素的改变通过细胞生长因子、细胞生长周期、信号传导通路及转录因子等多种方式调节VSMCs表型转换，引起VSMCs的增殖、转化、迁移、钙化和凋亡异常，参与粥样斑块的发展。并且它们之间不是单一的作用关系，而是相互作用、相互影响，形成复杂的作用网络，共同作用于动脉粥样硬化。动脉粥样硬化性血管疾病作为一种世界范围内人类死亡的主要原因，随着人类基因组学的发展，表观遗传学在慢性疾病发生和发展中的重要作用逐渐被认识，且目前更多的研究集中在血管内皮细胞和巨噬细胞在其发生发展中的作用，在血管平滑肌细胞方面的研究较少，本文主要总结了表观遗传学在血管平滑肌细胞方面的作用。然而关于表观遗传学因素的改变及参与动脉粥样硬化的具体机制尚未完全阐明，希望随着表观遗传学和动脉粥样硬化疾病机制研究的不断深入，其在动脉粥样硬化疾病的发生发展过程中的作用不断被完善，为减慢动脉粥样硬化疾病进程及其预测和治疗提供更多的依据，为人类慢性病的防治打开新局面。