TSHR-B亚基的结构、功能及其与自身抗体TSBAb在自身免疫性甲状腺疾病诊治中应用的研究进展▲

苏鑫安 薛冀苏 陈 慧

(1 兰州大学第二医院内分泌代谢科，甘肃省兰州市 730030； 2 深圳市宝安区人民医院内分泌代谢科，广东省深圳市 518101)

【提要】 自身免疫性甲状腺疾病(AITD)在临床上比较常见，包括Graves病、桥本甲状腺炎、产后甲状腺炎等疾病。研究显示，促甲状腺激素受体(TSHR)通过与促甲状腺激素受体抗体(TRAb)相结合来调控AITD的发生和发展。TSHR包含TSHR-A亚基和TSHR-B亚基，TRAb分为TSHR刺激性抗体(TSAb)和促甲状腺激素(TSH)刺激阻断性抗体(TSBAb)，TSAb通过与TSHR-A亚基结合，模拟TSH的作用，刺激甲状腺滤泡细胞增生和功能增强，引起甲状腺功能亢进；TSBAb通过与TSHR-B亚基结合，能抑制甲状腺增生和甲状腺激素的合成和分泌，导致甲状腺功能减退和甲状腺萎缩。目前，已有大量有关TSHR-A亚基及其自身抗体TSAb的研究，但鲜见有关TSHR-B亚基的研究。研究TSHR-B亚基及其自身抗体TSBAb对AITD的诊治尤为重要，故本文就TSHR-B亚基的结构、功能及其与自身抗体TSBAb在AITD诊治中的应用等研究进展进行综述。

促甲状腺激素受体(thyroid-stimulating hormone receptor,TSHR)存在于甲状腺滤泡上皮细胞和其他多种细胞的质膜上，是一种7次跨膜糖蛋白受体，属于G蛋白偶联受体[1]。TSHR能和促甲状腺激素(thyroid-stimulating hormone,TSH)结合，是T淋巴细胞和自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease,AITD)TSHR抗体(TSHR antibody,TRAb)最常见的抗原靶点[2]。TSHR主要由TSHR-A亚基和TSHR-B亚基组成，两个亚基通过C肽二硫键形成TSHR的二级结构。TRAb是一组多克隆抗体，主要包括TSHR刺激性抗体(TSH receptor stimulating antibody,TSAb)和TSH刺激阻断性抗体(TSH-stimulation blocking antibody,TSBAb)两种类型。病理条件下，TSAb和TSBAb分别作用于TSHR上的A、B亚基，介导AITD的发生和发展。本文对TSHR-B亚基的结构、功能及其与自身抗体TSBAb在AITD诊治中的应用等研究进展进行综述，以期为探讨AITD的发病机制、诊断、治疗及评估预后提供参考依据。

1 TSHR-B亚基的结构和功能

TSHR基因位于染色体14q31.1上，由10个外显子和9个内含子组成，TSHR-B亚基主要由TSHR基因第10号外显子编码。TSHR有764个氨基酸，B亚基的C末端位于TSHR的第764位氨基酸残基，但对于B亚基的起始位点目前尚未达成共识，诸多研究者采用不同的划分方法，得到的B亚基的相对分子质量大小不一。目前最常见的划分方法为B亚基的N末端起始于TSHR的第370位氨基酸残基，相应的B亚基的相对分子量约为45 000。其他较常见的划分方法还有第310～764位氨基酸残基、第367～764位氨基酸残基、第380～764位氨基酸残基，对应的B亚基的相对分子量分别为52.6 000，45.3 000和42 000[3-4]。但迄今为止，TSHR-B亚基的大小及划分规范仍未统一。B亚基是跨膜兼细胞内的亚单位，主要包括一小段胞外域、跨膜结构域和胞内区(胞质羧基端部分)，具有信息传递、维持自身三维结构及生物活性等功能。

1.1 胞外域 B亚基的胞外域主要指TSHR的第370～418位氨基酸残基，此片段含有潜在的磷酸化位点、C-激酶和G-蛋白偶联受体激酶，负责接收TSH信号并将信号传导至胞内[5]。B亚基胞外域的第381～385位氨基酸残基和A亚基上的第246～260位氨基酸残基、第277～296位氨基酸残折叠在一起，形成一个“结合口袋”以便与TSH结合[6]。其中，第385位氨基酸(酪氨酸)残基和第390位氨基酸(半胱氨酸)残基是与TSH结合的重要部分，它们对TSHR空间构象发挥着决定作用[7]。TSHR翻译后修饰导致部分A亚基及C肽从B亚基上脱落，使B亚基上硫酸化的酪氨酸残基暴露在胞外，以便于TSH及TSBAb与TSHR结合[8]。B亚基的胞外域是它的免疫原性区段，也是AITD抗原决定簇所在的重要部位。研究表明，TSBAb在B亚基的结合靶点主要有第370～386位氨基酸残基、第382～401位氨基酸残基、第392～415位氨基酸残基等，这些表位以散在不连续的方式分布，参与TSBAb与TSHR的结合[9]。

1.2 跨膜结构域 B亚基的跨膜结构域7次穿膜，呈蛇形，共有264个氨基酸残基(第419～682位氨基酸残基)，将胞外信号传递给G蛋白，包括7个跨膜螺旋(TM1～TM7)、3个胞外环(e1～e3)和3个胞内环(i1～i3)；B亚基跨膜结构域中存在铰链区，这个部位对于TSHR与TSH的结合，以及TSHR激活后向细胞内进行信号转导起着非常重要的作用[10]。一般情况下TSHR处于非激活状态，而它的激活依赖于受体内抑制的解除，这种抑制作用除了与A亚基和B亚基细胞外环之间的静电相互作用有关，还与B亚基跨膜部分的分子开关有关[11]。B亚基TM5中的第601位氨基酸残基、TM6中的第633位氨基酸残基、TM7中的第674位氨基酸残基被认为是G 蛋白偶联的分子开关[12]，它们协同影响TSHR的激活。当TSHR被激活后，胞内环i2中的第525～530位氨基酸残基参与Galphas/Galphaq双重蛋白激活、i3中的第605～622位氨基酸残基参与Galphaq介导的信号传导[13]、i3中第652～656位氨基酸残基的疏水簇通过影响G蛋白的活化，它们共同影响TSHR的分子内信号转导[14]，同时B亚基的3个胞外环负责维持TSHR的结构和活性。

B亚基跨膜结构域容易突变并使TSHR产生独特的刺激性反应，与AITD的发生密切相关[15]。如B亚基跨膜部分第486位氨基酸残基/第568位氨基酸残基/第656位氨基酸残基三重突变，TSH信号传导可增加70倍[16]；TM6中F631S处的突变可使激动型G蛋白介导的环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)途径激活，促进甲状腺激素的产生和甲状腺生长[17]；胞内环i3中第617～620位氨基酸残基的突变可导致功能性甲状腺腺瘤[18]。开展针对这些区域基因突变的研究可协助探索相关B亚基跨膜片段的功能。

1.3 胞内区 B亚基胞内区有82个氨基酸残基(第683～764位氨基酸残基)，并有一个C端和C激酶磷酸化位点与G蛋白偶联，负责将胞外信号传递到胞内而产生效应，对TSHR的信号传导活动至关重要[19]。有研究报告，B亚基胞内区尾段第691位氨基酸残基有助于保持TSHR 在激动型Gα蛋白/cAMP 通路中的非激活状态，而且在Gαq/11蛋白/磷酸肌醇级联中亦起关键作用[20]。B亚基第684～692位氨基酸残基及其相邻的胞内区域在激动剂诱导的磷酸肌醇信号传导中也有重要作用[21]。

2 TSHR-B亚基与其自身抗体TSBAb

TSHR是导致AITD发生和发展的最主要自身抗原之一，其中A、B亚基发挥着最主要的致病作用[22]。TSHR产生的自身抗体称为TRAb，主要分为TSAb和TSBAb。TSAb与TSHR氨基端的A亚基结合形成复合体，激活腺苷酸环化酶-CAMP通路系统，导致甲状腺功能亢进及甲状腺细胞增生；A亚基可从跨膜的B亚基上脱落，在病理条件下暴露的B亚基可诱导TSBAb的产生[8]，TSBAb与TSHR羧基端的B亚基结合后，通过竞争性结合影响TSH与TSHR的结合，阻断TSHR的信号传导进而产生抑制效应，从而抑制甲状腺激素的分泌，导致甲状腺功能减退(简称甲减)和甲状腺细胞萎缩[23]。

研究表明，TSBAb通过与TSHR-B亚基相结合，与AITD的发生有关[24]。据统计，约10%的AITD患者为TSBAb阳性[25]，其中多数为甲减相关的AITD，如桥本甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎、黏液性水肿等[26-28]，随着体内TSBAb水平的降低，患者甲减症状逐渐恢复。TSBAb还可出现在Graves病患者中，Graves病患者在接受抗甲状腺药物治疗期间或治疗后均可检测到较高的TSBAb[29]。还有学者通过CT扫描发现，TSBAb水平与Graves眼病症状呈强负相关性[30]。此外，有研究显示随着TSBAb水平的降低，TSBAb阳性的甲减患者可发展为甲亢[31]，是自身免疫性甲减向甲亢自发性转化可能的影响因素。可见TSBAb与AITD的发生密切相关，并且这种相关是通过其与TSHR-B亚基相互作用引起的，因此开展有关TSHR-B亚基及其自身抗体TSBAb的相关研究具有重要临床意义。

3 TSHR-B亚基及其自身抗体TSBAb在AITD中应用的前景分析

3.1 TSBAb应用于诊断及评估AITD的价值 大量研究表明，TSBAb有助于AITD的诊断和病情评估，是一种鉴别可逆性甲减的指标。例如，Wallaschofski等[32]发现采用TSBAb进行筛检，可早期发现TRAb相关性AITD患者及新生儿甲减，及时进行早期治疗可取得最大的临床治疗效果。然而，目前国内外对TSBAb的检测方法均有一定的局限性，如放射受体分析法只能检测TRAb总和，不能区分TSAb和TSBAb；化学发光法检测TSBAb操作步骤烦琐，流程长且价格昂贵，目前多用于科研，在临床上难以应用推广。近年来，众多研究者基于TSHR-B亚基蛋白制备的酶联免疫分析法检测试剂盒为TSBAb的检测提供了新的方法，如李宁[33]通过在原核系统表达截短的B亚基片段开发出以检测人血清TSBAb为主的TRAb/TSBAb-CLEIA试剂盒，提高了血清TSBAb检测的敏感性及特异性；周静[34]以TrxTSHRn(B亚基片段)蛋白为抗原建立的TSBAb检测方法，对桥本甲状腺炎伴甲减的诊断具有重要意义。这些基于TSHR-B亚基制备的酶联免疫分析法检测试剂盒提高了临床上检测TSBAb的准确性，且不需要额外的特殊仪器，未来可为AITD的临床诊断及治疗提供帮助。

3.2 TSHR-B亚基应用于自身免疫性甲减动物模型的制备 国内外关于自身免疫性甲减的动物模型研究较少，目前改模型的构建方法有脾细胞体外活化移植免疫法、自发性甲状腺炎模型法、基因工程小鼠模型法及外源性甲状腺抗原免疫法等[35]。脾细胞体外活化法是将实验小鼠的脾细胞在体外培养，使用特定的异源信号肽免疫后再次注射入同源受体小鼠体内，使之发生自身免疫性甲减，此法可加重甲状腺淋巴细胞的浸润，并且会引起肉芽肿性改变，主要用于研究肉芽肿性甲状腺炎。自发性甲状腺炎模型法主要使用具有自身免疫倾向的NOD.H-2h4小鼠和OS鸡[36]，这些实验动物可自发性形成遗传性自身免疫性甲减，成功率较高，但这些实验动物需在无特定病原体清洁等级下喂养，成本较高且疾病周期较长。基因工程小鼠模型主要通过基因重组技术获得，此法成本高，效率低且重复性差，目前其使用价值仍在研究探索中。外源性甲状腺抗原免疫法是一种较为成熟的造模方法，相对于其他方法具有操作较容易、造模周期短、实验经费较低等优点。众多研究者将TSHR-A亚基蛋白通过质粒、腺病毒等载体注入小鼠体内成功诱发了Graves动物模型[37-38]。岳瑞宏[39]则使用TSHR胞外段羧基端蛋白(B亚基片段)免疫Balb/c小鼠，诱发类似于自身免疫性甲减的激素改变及甲状腺组织病理改变，这为建立自身免疫性甲减动物模型提供了新的思路。此法不仅简便可行、重复性高，并且能模拟自身免疫性甲减的发生及发展，适用于观察甲状腺细胞的病理及结构变化。

3.3 TSBAb单克隆抗体的制备 人工获得的TSHR-B亚基蛋白可协助动物源性TSBAb单克隆抗体的制备，对AITD的预防及治疗意义重大。目前，TSBAb单克隆抗体主要包括5C9、K1-70、RSR-B2、Tab-8、7G10等[40]，其中5C9、K1-70为人源性单克隆抗体，RSR-B2、Tab-8、7G10为动物源性单克隆抗体。人源性单克隆抗体是直接分离人类体内B淋巴细胞，通过杂交瘤技术制备而得；动物源性TSBAb单克隆抗体通过将人工获得的TSHR-B亚基蛋白注入动物体内的方法获取。相对人源性单克隆抗体，动物源性单克隆抗体的制备操作较简单，实验周期短，经费较低，易于实现，可用于初期实验。通过TSHR-B亚基蛋白获得的TSBAb单克隆抗体，除可用于研究TSBAb与TSHR结合的分子生物学机制外，还可用于TSBAb检测手段的研发及探索AITD的发病机制及其诊断治疗。

3.4 TSBAb检测对于妊娠期妇女及新生儿的意义 当妊娠期妇女合并自身免疫性甲减时，其体内TSBAb常为阳性，并可通过胎盘影响胎儿体内甲状腺激素平衡，导致新生儿甲减[41]。对妊娠合并自身免疫性甲减的妇女进行TSBAb检测，可以评估新生儿的甲状腺功能，并且对新生儿是否会患有暂时性甲减具有重要的预测意义。最新研究表明，妊娠期Graves病患者的TSAb水平总体呈下降趋势，而TSBAb水平呈升高趋势，妊娠期TSBAb水平的增加可能有助于妊娠期甲亢的缓解[42]。在妊娠期妇女中开展对上述现象的研究，有助于探索免疫疗法以实现AITD的病情缓解及新生儿甲减的预防。

4 小 结

AITD的主要病因之一是TRAb升高，其中TSBAb可以通过与TSHR-B亚基相互作用介导甲减相关的AITD的发生与发展。开展有关TSHR-B亚基的结构和功能、B亚基与TSBAb的关系及其应用的研究，对深入探讨AITD的诊断、治疗、预后评估及发病机制具有重要意义，有望为建立新的AITD诊断和治疗模式提供参考依据。