ASM在免疫调节及自身免疫性疾病中的研究进展①

赵萌萌 田百玲 赵 珊 刘旭东（中国医科大学附属第一医院，沈阳 110001）

鞘脂类化合物是主要的细胞膜结构成分，作为细胞膜结构上的“组织者”，同时也调控着细胞与外界的信号传导，与许多细胞功能息息相关。鞘脂类化合物相互代谢是在多种酶的参与调节下逐步进行的。鞘脂类化合物的结构复杂，种类繁多，目前已被确认的有300余种。国际上尚无统一明确的分类，现多将其分为简单鞘氨醇类、神经酰胺类、鞘磷脂类、神经苛醐旨类、鞘糖脂等。神经酰胺是鞘脂类化合物的核心，通过重组给定的信号体，在细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡、调节免疫及参与应激反应等方面发挥诸多功能［1］。酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase，ASM）作为神经酰胺打捞途径中最为重要的合成相关酶，通过水解鞘磷脂（sphingmyelin，SM）生成神经酰胺，在免疫细胞调节、炎症性疾病和肿瘤中的研究愈加受人瞩目［2-4］。本文将对ASM/神经酰胺通路在代谢途径、免疫细胞调节和自身免疫性疾病等方面进行综述。

1 ASM/神经酰胺代谢途径

1.1神经酰胺 神经酰胺是鞘脂类化合物的核心代谢产物，与胆固醇和SM一起构成真核细胞质膜的“脂筏”，由神经鞘氨醇长链碱基与脂肪酰基侧链共价结合形成［5］。其生成主要通过两种途径：内质网发生的从头合成途径和其他鞘脂类化合物转化而来的打捞途径。从头途径是丝氨酸和棕榈酰基辅酶A在转移酶作用下形成3-酮基双氢鞘胺醇，通过还原酶转变成双氢鞘氨醇，再经神经酰胺合成酶（ceramide synthase，CerS）作用，生成双氢神经酰胺，最后通过脱氢酶的脱氢而转变为神经酰胺［6-8］。

打捞途径主要由两方面组成：直接水解途径，SM在鞘磷脂酶（sphingomyelinase，SMase）的水解作用下，生成神经酰胺，其中SMase主要包括ASM、中性鞘磷脂酶（neutral sphingomyelinase，NSM）和碱性鞘磷脂酶（alkaline sphingomyelinase）3种［9-10］；在酸性β葡糖苷酶1（acid β-glucosidase 1，GBA1）作用下，由葡糖神经酰胺（glucosylceramide，GlcCer）形成［11］。

相反，神经酰胺也可以作为底物生成其他鞘脂。如，在鞘磷脂合成酶（sphingomyelin synthase，SMS）作用下生成SM；在葡糖神经酰胺合成酶（glucosyleceramide synthase，GCS）作用下生成GlcCer；在神经酰胺酶（ceramidase，CDase）作用下生成鞘氨醇，并进一步在鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SPHK）作用下，生成1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate，S1P）；在神经酰胺激酶（ceramide kinase，CERK）的作用下生成神经酰胺-1-磷酸（ceramide-1-phosphate，C1P），发挥不同的生物作用［12-13］。

神经酰胺不仅是重要的细胞膜组成物质，它作为第二信使，通过调整细胞膜生物物理性质、膜内蛋白质的功能及分布从而导致信号通路的激活过程，参与多种细胞生物学活动和功能。生物学功能包括：①诱导细胞凋亡，神经酰胺可通过激活caspases途径诱导凋亡，并与线粒体膜通透性改变关系密切［14-15］；②神经酰胺与应激反应相关，可以参与皮肤、神经系统、角膜及视网膜上皮细胞的分化、增殖［16-17］；③神经酰胺通过激活或抑制关键效应分子，触发多种肿瘤抑制和抗增殖的细胞程序，如凋亡、自噬、衰老和坏死。神经酰胺具有强大的、多用途的抗肿瘤活性［18-19］；④神经酰胺相关酶和下游代谢产物可以调节免疫细胞功能和参与炎症反应等［3］。

1.2ASM人类ASM的编码基因鞘磷脂酶磷酸二酯酶1（sphingomyelinase phosphodiesterase 1，SMPD1）长5～6 kb，定位于11p15.1～11p15.4号染色体，包含6个外显子和5个内含子［20］。ASM由3个主要结构域组成：N端皂苷结构域、富脯氨酸连接体结构域和催化结构域［21］。ASM基因编码产生两种不同转运途径和分布的酶，即溶酶体型ASM（lysosomal sphingomyelinase，L-ASM）和分泌型ASM（secretory sphingomyelinase，S-ASM）。L-ASM分布于细胞内溶酶体，而S-ASM分泌至胞外，存在于人体的血液及包括关节炎在内的多种组织液中［22-23］。N-糖基化位点的突变影响L-ASM和S-ASM的催化活性和胞内过程。L-ASM在转运到溶酶体酶途中，与细胞内Zn2+离子相结合进而活化；而S-ASM的激活则通过转运至细胞膜上，与外源性Zn2+离子结合完成［24］。

ASM生物学活性约占SMase总活性的90%，在SM代谢中起着重要的作用，它将SM水解成神经酰胺和磷酸胆碱，是神经酰胺生成的重要途径。而当SMPD1基因突变引起ASM缺乏时，SM蓄积于神经系统和实质脏器，导致溶酶体蓄积病——尼曼匹克病的发生［25］。虽然ASM在pH=4.5～5.0时酶活性最佳，但在pH较高接近中性时可催化细胞膜上LDL-SM水解［9］。ASM可被多种外界刺激激活，包括细胞因子（如TNF家族、IL-1β）、死亡受体（如CD95、DR5）、多种细菌及病毒感染、化疗药物（如顺铂）、放射线和紫外线等［26-31］。受体信号诱导的ASM激活可以发生在受体信号体与溶酶体融合后的细胞内如肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNF-R），也可以发生在酶从溶酶体内储室转移到质膜的鞘外小叶后的细胞外（如CD95）［32］。而在激活ASM过程中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）作为第二信使介导受上述刺激后的细胞反应，是触发ASM移位和活化的必需上游信号［33］。

ASM被激活后，水解细胞膜上SM的磷酸二脂键，生成的神经酰胺彼此相互作用，形成富含神经酰胺的小膜域。这些小的结构域在信号转导中起作用，并能进一步融合到大的富含神经酰胺的结构域—信号平台。直接水解途径（ASM）被认为是众多神经酰胺生成途径中最为迅速和直接的。ASM的激活和随后生成的神经酰胺对细胞应激反应至关重要［34］。ASM/神经酰胺通路的激活，导致了S1P生成的增加，促进多种前炎症细胞因子的生成［35］。通过ASM水解SM产生的神经酰胺改变了生物膜的生理特性，富含神经酰胺的信号平台在各种刺激下重组受体和信号分子，在调节细胞分化、增殖、凋亡等广泛的生物学行为方面发挥重要作用［36-37］。而ASM/神经酰胺通路同样参与免疫细胞在体内的功能调节，进而参与肿瘤、急慢性炎症和自身免疫性疾病的发病和发展。

2 ASM/神经酰胺对固有免疫细胞的调节

固有免疫系统又称为天然免疫或非特异性免疫，会非特异地识别并作用于病原体，具有迅速的抗感染作用，在机体防御机制中具有重要作用。参与固有免疫系统的细胞包括：吞噬细胞（包括单核/巨噬细胞和中性粒细胞）、树突状细胞（dendritic cell，DC）、自然杀伤细胞（natural killer cells，NKs）和NK/T细胞、肥大细胞等。ASM/神经酰胺通路可以调节固有免疫细胞功能，参与炎症反应。

2.1单核/巨噬细胞 外周血单核细胞和各组织中巨噬细胞作为重要的吞噬细胞，在固有免疫中发挥重要作用。病原体、某些细胞因子、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等与巨噬细胞表面的Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）等模式识别受体结合，启动相应的信号转导通路，激活胞内生化反应，发挥增殖、趋化和吞噬功能。LPS在体内和体外均可刺激巨噬细胞引起氧化应激，进而激活ASM产生神经酰胺，诱导TLR4向胞膜脂质筏的聚集，从而增加LPS的响应性和细胞启动，促进炎症反应［38］。除此以外，LPS和棕榈酸（palmitic acid，PA）诱导的ASM活化，可致巨噬细胞分泌促炎因子IL-6增加［39］；而ASM抑制剂（NB06）则能下调巨噬细胞中促炎因子IL-1β、IL-6、IL-23A和趋化因子CCL4和CCL20的基因表达以及抑制NLRP3（NOD-like receptor family，pyrin domain-containing 3）炎症小体的激活，从而发挥抗炎作用［40-41］。ASM/神经酰胺信号通路通过内质网应激通路参与了氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的巨噬细胞凋亡，诱发轻度的持续性炎症，在动脉硬化的进展期发挥了重要作用［42-43］。

2.2NK细胞和NKT细胞NK细胞和NKT细胞均来源于淋巴细胞，NK细胞对肿瘤细胞、病毒或细菌感染的等靶细胞具有直接杀伤作用，在固有免疫中发挥抗感染、抗肿瘤和免疫调节作用。IL-2缺乏的NK/NKT细胞，可以通过磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidyl inositol-3 kinase，PI3K）通路激活ASM，减少神经酰胺的生成，诱导了胞浆组织蛋白酶B（cathepsin B，CTSB）和caspase依赖的细胞凋亡，以及介导X-连锁的凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）的降解，明确了NK/NKT细胞凋亡的新途径［44］。ASM基因敲除小鼠会出现胸腺中主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类糖蛋白CD1d限制性抗原呈递和不变自然杀伤T细胞（inviarant natural killer T cells，iNKT）细胞选择减少，导致iNKT细胞水平降低，并对iNKT细胞介导的炎症条件产生抵抗力［45］。

2.3DC DC作为重要的抗原提呈细胞，是适应性免疫的主要启动者，在固有免疫和适应性免疫系统中均发挥重要作用。DC的凋亡伴随着ASM激活而产生的神经酰胺增多，未成熟DC较成熟DC具有更高水平的ASM，进一步抑制ASM的激活和神经酰胺的产生能够使免疫调节信使NO保护未成熟DC免受大肠杆菌和LPS诱导的凋亡［46］。DC细胞表面受体DC-SIGN与HIV或麻疹病毒连结能快速激活ASM和NSM，随后神经酰胺在外膜小叶中聚集；SMase活化不仅在促进DC-SIGN信号转导中起重要作用，而且在增强DC对病原体的摄取方面也起着重要作用［47］。

2.4肥大细胞 肥大细胞来源于造血干细胞，分布皮肤、呼吸道、胃肠道黏膜下结缔组织和血管壁周围，在固有免疫中发挥较弱的吞噬作用、抗原提呈、趋化及致炎效应，同时可参与Ⅰ型超敏反应。SMase和神经酰胺可以诱导重组白细胞介素-3（rIL-3）和/或重组干细胞因子支持的小鼠骨髓来源的肥大细胞的凋亡［48］。ASM在野生型小鼠肥大细胞收到抗原刺激后迅速被激活，并参与抗原诱导的Ca2+浓度升高、K+通道激活以及β己糖苷酶迁移和释放，在肥大细胞介导的超敏反应中发挥作用［49］。

综上所述，ASM/神经酰胺通路对于固有免疫细胞的调节作用主要是参与调节固有免疫细胞凋亡以及调控信号转导通路，从而在固有免疫细胞吞噬、趋化、抗原提呈及促炎效应等多方面发挥重要作用。

3 ASM/神经酰胺对获得性免疫细胞的调节

适应性免疫系统又称获得性免疫或特异性免疫，分为细胞免疫（T淋巴细胞介导）和体液免疫（B淋巴细胞介导）。抗原刺激是引起机体产生适应性免疫应答的先决条件，而免疫细胞则是完成应答的物质基础。在某些情况下，适应性免疫应答可能对机体产生损害，引起超敏反应或自身免疫性疾病。ASM/神经酰胺通路参与B细胞和T细胞的细胞分化和功能调节等生理和病理过程。

3.1T细胞T细胞作为适应性免疫中细胞免疫的效应细胞，根据其分子生物学特征分别不同的T细胞亚型，发挥不同的免疫功能。大致分为：CD4+效应性T细胞（也称辅助性T细胞，helper T cell，包括Th1、Th2、Th17等）、CD4+调节性T细胞（regulaotory T cell，Treg）、CD8+T细胞（主要为细胞毒性T细胞，cytotoxic T lymphocyte，CTL）和记忆性T细胞（memory T cell）。ASM/神经酰胺对不同亚型的T细胞发挥不尽相同的作用。

既往研究普遍认为ASM通过水解SM和产生神经酰胺，在人CD4+T细胞中充当细胞内信号的调节因子［9］。ASM在抗CD3/CD28抗体刺激T细胞后被激活，促进神经酰胺生成，分别通过CD3-ZAP70-PLC-γ1-MAPK/JNK CD28-PI3K-Akt-mTOR通路介导CD4+T细 胞 活 化 和 增 殖、并 向Th1细 胞 分 化［50］。ASM还 参 与Th17细 胞 的 分 化，即 抗CD39或/和CD161可以激活ASM，诱导神经酰胺产生，介导包括信号转导子和转录激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）在内的下游信号持续活化，从而诱导Th17细胞的分化，参与炎症性疾病发生［51］。

而ASM调节Treg细胞的作用与效应性T细胞恰恰相反。ASM缺陷小鼠较野生型小鼠体内的Treg细胞数量更多，同时ASM缺乏的CD4+T细胞中PI3K-Akt信号通路激活受损，从而导致FoxP3表达增强和Treg分化［52］。另一项研究提示，TGF-β和IL-2体外刺激ASM缺陷的T细胞可以诱导更多的Treg细胞。应用ASM抑制剂处理的小鼠及人T细胞，也可以诱导CD4+T细胞中Treg细胞的比例升高［53］。以上研究证实了ASM/神经酰胺对于Treg细胞的负向调节作用。

ASM可以通过调节细胞毒颗粒和细胞毒效应分子的分泌调节CD8+T细胞的细胞毒活性［54］。ASM参与了保护记忆T细胞对抗糖皮质激素诱导的细胞死亡（glucocorticoid-induced cell death，GICD）［55］。综上所述，ASM/神经酰胺通路在不同的亚型T细胞生物学进程和细胞免疫相关信号均发挥重要作用。

3.2B细胞B细胞被认为是体内唯一能产生抗体（免疫球蛋白）的细胞，B细胞抗原受体（B-cell receptor，BCR）通过识别不同抗原表位激活B细胞，继而分化为浆细胞，产生特异性抗体，发挥体液免疫功能。前B细胞表面抗原CD20单克隆抗体利妥昔单抗作用于B淋巴瘤细胞后激活BCR，脂筏微区的ASM活性和神经酰胺的生成迅速而短暂地增加，并与CD20受体共定位，此外，还与鞘磷脂磷酸二酯酶3b（SMPDL-3b）蛋白结合，调节ASM活性，在B淋巴瘤和局灶节段性肾小球硬化发挥治疗作用［56-57］。创伤造成B细胞质膜的损伤，在质膜修复的过程中将破坏ASM/神经酰胺所在的脂筏与BCR的共聚体，进而抑制BCR信号传导［58］。

ASM/神经酰胺通路可以参与激活固有免疫、协助抗原提呈，调节固有免疫细胞和适应性免疫细胞功能，在适应性免疫应答过程中发挥重要作用，参与全身炎症反应，从而参与到急慢性炎症性疾病和自身免疫性疾病的发生发展进程。

4 ASM/神经酰胺对自身免疫性疾病和炎症疾病影响

ASM/神经酰胺通路广泛参与肿瘤、细菌/病毒感染性疾病、急性呼吸窘迫综合征、囊泡性纤维症、动脉硬化等疾病的发病［59-64］。在ASM水平的变化可以调节肿瘤部位免疫细胞的表达从而重塑肿瘤免疫微环境［65］。除此以外，基于对固有免疫和适应性免疫系统的重要作用，ASM/神经酰胺通路参与器官特异性和全身性自身炎症性疾病和自身免疫性疾病的发病进程。

4.1多发性硬化 多发性硬化表现为中枢神经系统脑白质炎症脱髓鞘病变的自身免疫性疾病。在胶质细胞的研究中发现，激活ASM是神经胶质细胞形成微粒脱落并释放IL-1β的至关重要的因素［66］。在中毒性脱髓鞘模型的研究中，与野生型小鼠相比，ASM基因敲除小鼠在2周后髓磷脂恢复增加，少突胶质细胞计数升高，有害星形胶质分布也明显减少，应用ASM抑制剂也获得了类似的结果，表明ASM在髓鞘修复中起到重要作用，也为MS提供了新的治疗方法［67-68］。

4.2脂肪性肝炎（steatohepatitis，SH）SH分为酒精性和非酒精性，是最常见可进展为肝硬化和肝癌的慢性肝病之一。而ASM/神经酰胺通路参与激活调节脂肪变性、纤维化和脂肪毒性等关键途径，包括内质网应激、自噬和溶酶体膜渗透等，在SH过程中，ASM作为关键作用酶通过TNF、ROS及氧化应激激活，从而介导应激反应和细胞凋亡［69］。同时参与SH中调节甲基化反应、抗氧化防御和膜完整性的两个关键事件即调节蛋氨酸循环和磷脂酰胆碱稳态［70］。综上，靶向抑制ASM激活可以通过多种途径在SH中发挥治疗作用。

4.3炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）IBD主要包括克罗恩病（crohn disease，CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC），是由于胃肠道黏膜免疫系统失调引起慢性、反复性炎症性疾病。LPS诱导的巨噬细胞与结肠细胞共培育时，结肠细胞的活性明显下降，应用ASM抑制剂进行处理后，结肠细胞的存活率没有下降；在同一篇文献中，ASM抑制剂可以显著降低葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium，DSS）诱导的结肠炎小鼠结肠细胞因子水平和结肠损伤的严重程度［71］。而在病原体鼠柠檬酸杆菌诱导的结肠炎小鼠模型中抑制ASM的小鼠对感染有很强的敏感性，ASM-/-小鼠较野生型小鼠表现出更为显著的Th1和Th17炎症反应，同时伴有更为严重的结肠病理表现［72］。ASM可以通过调节多种免疫细胞功能参与不同病因诱导的IBD病理过程。

4.4类风湿关节炎（rheumatoid ahritis，RA）RA是一种以慢性破坏性关节病变为特征的全身性炎性自身免疫病［73］。具有RA高危因素和遗传易感性的人群，在无关节症状前已经出现自身免疫激活（瓜氨酸化和新的表位形成），而在滑膜局部，成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）、抗原提呈细胞（antigen-presenting cells，APCs）和巨噬细胞等被激活产生一系列炎症因子，引发滑膜炎症。RA患者T细胞中长链非编码RNA（lncRNAs）LOC100506036的表达增加，siRNA抑制其表达后SMPD1表达降低［74］。在抗原诱导关节炎（antigeninduced arthritis，AIA）的过程中，ASM基因敲除小鼠较对照组，关节炎程度更轻；且应用ASM抑制剂组的AIA小鼠可以改善关节炎的严重程度［75］。另一项关于RA的研究，发现RA患者较健康对照组外周血清中S-ASM的活性增强［76］。因此，ASM可以作为RA中的早期炎症标志物参与炎症反应，但ASM参与RA的疾病发展的具体机制还需进一步研究。

4.5系统性硬化（systemic sclerosis，SSc）SSc也称硬皮病，是一种自身免疫性结缔组织病，在疾病中晚期表现为皮肤和脏器的广泛纤维化。而发生纤维化的主要原因在于正常的内皮细胞（endothelial cells，ECs）异常凋亡、循环中血管生成细胞（circulating angiogenic cells，CACs）数量下降以及成纤维细胞细胞凋亡的减少。关于SSc的研究发现，内皮细胞来源富含花生四烯酸的微粒，被CACs吞噬可以激活ASM，生成神经酰胺，启动细胞凋亡机制［77］。另一项研究则探讨了成纤维细胞对Fas介导的凋亡抗性增强，在SSc的成纤维细胞中ASM表达下降，而当ASM表达上调时，细胞恢复对Fas介导凋亡的敏感性［78］。因此ASM在SSc的纤维化进程中发挥重要作用。

4.6系统性血管炎 系统性血管炎以累及血管的非感染性炎症和坏死为基本病理表现的结缔组织病，依据受累血管分为：以大动脉炎（takayasu arteritis，TA）为代表的大血管炎、以结节性多动脉炎（polyarteritis nodosa，PAN）和川崎病（kawasaki disease，KD）为代表的中等血管炎和以ANCA相关性血管炎（antineutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis，AAV）为代表的小血管炎。在初治AAV患者的外周血中S-ASM的活性较对照组升高，通过激素和免疫抑制剂治疗后，到14周时，S-ASM的活性较前下降，在研究中推测由于AAV中内皮细胞功能异常导致分泌S-ASM升高［79］。另一项关于KD的研究也提示相似的结果，患者治疗前血清ASM活性明显升高，且ASM活性与C反应蛋白水平显著相关［80］。综上，ASM通过内皮功能异常参与系统性血管炎的炎症反应。

5 总结

ASM/神经酰胺通路不仅参与调节机体免疫细胞，还在多种免疫相关疾病和炎症性疾病的进程中发挥重要作用。一方面，激活ASM通过水解途径产生神经酰胺，富含神经酰胺的信号平台重组信号通路，调节免疫细胞分化、增殖、凋亡等细胞代谢过程；另一方面，ASM可以参与调节炎症信号转导通路，促进炎症细胞因子的释放和炎症反应。近年来对于ASM与免疫细胞的研究主要集中在于T细胞分化和调节Th17/Treg平衡等方面。虽然ASM/神经酰胺通路参与自身免疫性疾病和自身炎症疾病的具体机制还有待进一步研究和论证，但以地昔帕明、阿米替林等在内的多种三环类抗抑郁药为代表的ASM功能性抑制剂已经作为多发性硬化、炎症性肠病、脂肪型肝炎的治疗新策略［69，81］。因此ASM在风湿免疫病以及系统性自身免疫病中的临床应用仍具有巨大前景。