自发性先天性白内障大鼠毛色基因型鉴定*

董 敏 尤金炜 梁 磊 吴正林 田小芸

(南京大学医学院附属金陵医院实验动物室，南京 210002)

遗传上的高度纯合是对近交系动物的基本要求。根据国家标准，新建立的近交系需进行相应的遗传检测，国际上通用的遗传检测方法很多，其中毛色基因检测法是遗传监测的重要方法之一[1]。自发性白内障大鼠由本中心培育，经过10多年的连续近交繁殖，现已培育至第31代，暂定名为自发性先天性白内障大鼠(TSC)大鼠，理论上已经达到基因高度纯合，符合近交系动物的近亲繁殖代数要求，且具有自身独特的生物学特征[1]。本实验组已经对TSC大鼠各生理指标作了相应的检测与分析，已经做了晶状体的病理学研究、繁殖性能及生长发育实验、血液生化及血液流变学指标、脏器重量及系数以及血压与体温基础数据分析。另外，为了监测TSC大鼠的基因纯合度和遗传稳定性，我们对其毛色基因类型进行了测试，确定了其基因类型。

1 材料和方法

1.1 实验动物

1.1.1待测TSC大鼠：由东部战区总医院实验动物室提供，来自基础群的TSC大鼠，6～8周龄，体质量180～200 g，雌雄各半，毛色为白色，实验动物生产许可证号【SCXY(军)2017-0018】。

1.1.2已知复隐性基因大鼠：F344大鼠及BN大鼠由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供【SCXK(沪)2018-0006】。其毛色及基因型分别为白色(aaBBcc)和巧克力色(aabbCC)。

1.2 饲养管理及环境

实验大鼠均饲养在屏障环境中，室内的温湿度均由中央空调控制，温度为20～26 ℃，相对湿度为50%～70%，采用12 h∶12 h昼夜间断照明。使用许可证号【SYXK(军)2017-0037】。大鼠饲料为60Co辐射饲料，生产许可证号【苏饲审(2019)01008】，营养成分执行标准：Q/320115XT04-2019。饮水为消毒的酸化水，使用的垫料、盒子等用具均进行131 ℃ 5 min高压预真空灭菌。饲养由持证上岗具有大专及以上文化的熟练技师负责。

1.3 实验方法

1.3.1方法：将待测基因型的TSC大鼠雄性分别与已知基因型的F344大鼠及BN大鼠雌性按1∶2交配，同时将待测基因型的TSC大鼠雌性分别与已知基因型的F344大鼠及BN大鼠雄性按1∶2交配，每组7窝，生产后两周观察F1代仔鼠毛色，观察时间1～2周。再通过TSC与BN大鼠的F1代与亲本BN大鼠按1∶2回交，每组7窝，生产后观察仔鼠1～2周。通过以上已知复隐性亲本F344大鼠及BN大鼠的基因型、F1代大鼠的毛色基因表现型及F1代与亲本BN大鼠回交毛色基因型，综合判断TSC大鼠毛色基因的基因型。

1.3.2判断结果要求：纯系大鼠后代毛色应完全一致。出现异色者(如毛色变黄、腹印等)，即为不纯；被测品系用于交配的雌雄动物数均不少于7只，每个个体后代仔鼠观察数不少于7只。

2 结果

2.1 用已知复隐性基因的F344大鼠及BN大鼠与待测基因型的TSC大鼠相互交配

TSC大鼠与BN大鼠杂交，无论雌雄，其F1代所观察的大鼠毛色均呈一致的巧克力色，见图1 F1代B位点为Bb基因。TSC大鼠与F344大鼠杂交，无论雌雄，其F1代所观察的大鼠毛色均呈一致的白色，见图2，可能为白色隐性上位，说明其没有C基因，具体见表1。

图1 TSC与BN杂交F1Fig.1 F1 Hybridization of TSC and BN

图2 TSC与F344杂交F1Fig.2 F1 Hybridization of TSC and F344

图3 图1中杂交F1与TSC回交Fig.3 Backcross of TSC with F1 generation in Figure 1

表1 F1代仔鼠的毛色表型Table 1 Hair color phenotype of F1 generation

2.2 用TSC大鼠与BN大鼠杂交的F1代与TSC大鼠回交

TSC大鼠与BN大鼠杂交的F1代与TSC大鼠回交后，仔鼠出现黑、白、花色(图3)，初步推断F1代A位点为Aa基因，根据以上信息，推测TSC大鼠与BN大鼠F1代基因型为AaBbCc，具体见表2。

表2 F1代与TSC大鼠回交的毛色表型Table 2 Hair color phenotype of F1 generationbackcrossed with TSC rats

2.3 根据已知复隐性亲本的基因型及F1代仔鼠毛色表现型，对TSC大鼠毛色基因结果作出判断

已知复隐性基因大鼠BN大鼠(巧克力色)基因型为aabbCC，F1代基因型为aaBbBc，由此推测待测白内障大鼠TSC的基因型为aaBBcc。

3 讨论

3.1 控制毛色的基因分析

控制毛色的基因很多，受ABC 3个位点支配。A位点上基因所控制的是每根毛中色素的分布，基因A对a显性。基因型是AA或Aa时，色素在毛尖或根部含量高，中部少。基因为aa时，色素在毛中沉着均匀一致。B位点上基因与黑色素合成有关，基因B对b显性，基因型是BB或Bb时，可合成黑色色素，bb时合成褐色色素。A、B位点可组合成4种基本毛色：A-B为野生色；aaB为黑色；Abb为肉桂色；aabb为棕色[2-3]。C位点上基因与被毛毛色形成有关，基因C对c显性，基因型为CC或Cc时，被毛均为有色，基因型为cc时，被毛为白色，眼为红色。C位点具有隐性上位作用，当基因型为cc时，A、B位点无论怎样组合，被毛颜色均为白色[4-5]。

3.2 关于TSC大鼠的毛色基因位点纯合度和毛色基因型

TSC大鼠是由本单位在屏障环境SD大鼠生产的仔鼠中发现的5只先天性白内障大鼠，经过10多年近交繁育的新近交品系，已培育至第31代，暂命名为TSC大鼠，理论上已经达到基因高度纯合。本实验中，TSC大鼠与F344大鼠交配时，所生F1代颜色均为白色，初步推断C位点为cc，不含C基因。A、B两个位点尚不能判断。在TSC大鼠与BN大鼠交配所生的F1代仔鼠中，14窝仔鼠毛色均为巧克力色，已知BN大鼠基因型为aabbCC，结合前面结果，初步判断，F1代仔鼠B位点为Bb，C位点为Cc。根据其F1代与TSC大鼠回交，仔鼠出现黑色、白色、花色(图3)，初步推断其F1代A位点为Aa，根据以上判断，其F1代基因型应该为AaBbCc，因此证明TSC大鼠毛色基因为AABBcc。

在测试中，雌或雄性TSC大鼠分别与BN、F344大鼠杂交或回交，其F1代仔鼠毛色表型均为均一色，本次测试结果结合项目组前期做的晶状体病理学研究、繁殖性能及生长发育实验、血液生化及血液流变学指标、脏器重量及系数以及血压与体温基础等数据分析结果[6-10]，说明TSC大鼠毛色基因纯合度均达100%，遗传纯合度已达国家标准，是毛色基因位点高度纯合的自发性先天性白内障大鼠模型。