川楝子醇提物抑制急性淋巴细胞白血病细胞增殖的作用机制研究

苗玉迪 胡星星 王九菊 李艳春

(1 陕西省人民医院血液内科，西安，710068； 2 西安大兴医院检验科，西安，710016； 3 西安国际医学中心医院血液病医院实验诊断中心，西安，710018)

白血病在临床上较为常见，主要是由于造血干细胞于不同的阶段，出现凋亡受阻、失控性增殖、异常分化等情况，从而导致组织被大量的克隆性白血病细胞累积、浸润，最终影响正常的造血功能[1]。人急性T淋巴细胞为白血病最为常见的类型，主要起源于T系细胞，以恶性增殖为主[2]。对于此症，临床多采用化学疗法、造血干细胞移植等，但该类治疗方法不良反应较大，预后不佳[3]。因此，及时寻求一种有效、价格低廉的治疗药物为临床亟待解决的问题。川楝子为楝科落叶乔木植物川楝的成熟果实，主要产于贵州、四川等地，味苦、性寒，具有疏肝泄热、行气止痛等功效[4]。报道显示，该药可抑制神经递质、抗癌、抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡等，多用于治疗肝癌、胃癌等疾病中，但关于川楝子对白血病的应用机制及效果报道鲜见[5]。基于此，本文选择急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL)细胞株及雌性大鼠12只作为实验对象，展开以下分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与动物 选取2020年1月至2021年12月实验中心提供的人急性淋巴白血病细胞T淋巴细胞(CCRF-CEM)，患者均知情同意，本研究通过陕西省人民医院医学伦理委员会审批(伦理审批号：2020PS001K)及无特定病原体Specific Pathogen Free，SPF)动物级6周Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠12只购自山东省鲁抗医药股份有限公司(动物生产许可证号：SCXK2013-0001)，体质量为(310.00±10.00)g，饲养条件：室温20～26 ℃，相对湿度：50%～70%，单笼喂养，喂饲粉状基础饲料，自由摄食、饮水，实验过程遵循3R原则，给予人道主义关怀。1)诊断标准参考《中国急性早幼粒细胞白血病诊疗指南(2018年版)》符合白血病诊断标准。2)纳入标准：符合诊断标准；SPF级6周SD大鼠雌性大鼠；体质量≥300 g。3)排除标准：对川楝子等过敏大鼠；合并有严重恶性肿瘤大鼠；合并感染性、血液系统疾病大鼠。4)脱落及剔除标准：中途由于其他因素无法继续参与研究；中途意外死亡大鼠。

1.1.2 药物 川楝子(上海源叶生物科技有限公司，CAS编号：79304-40-8)。

1.1.3 试剂与仪器 乙醇(新乡市先丰医药新材料有限公司，国药准字F20110002)，ECL发光液(上海士锋生物科技有限公司，货号：R-2374-50 mL)，噻唑蓝试剂(Thiazole Blue，MTT)(上海谱振生物科技有限公司，CAS编号：298-93-1)；兔抗人单克隆一抗Bcl-2相关X蛋白(BCL2-associated X，Bax)(Abcam公司，美国，货号：ab109536)，兔抗人单克隆一抗P53(Abcam公司，美国，货号：ab7015)，兔抗人单克隆一抗B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bax(Abcam公司，美国，货号：ab8926)，P53羊抗兔二抗(Abcam公司，美国，货号：ab9358)，细胞裂解液(碧云天生物技术有限公司，批号：P0013B)，RPMI1640培养基(Invitrogen公司，美国，货号：186025)，聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride,PVDF)膜(Millipore公司，美国，货号：ISEQ00238)，TRIzol、RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN GmbH公司，德国，货号：74106)；SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(TaKaRa公司，货号：DRR041A)；粉碎机(扬州诺亚机械有限公司，型号：SF50)，圆底烧瓶(泰州市六六顺教学设备有限公司，规格：2 000 mL，型号：GG17)，旋转蒸发仪(北京金洋万达科技有限公司，型号：YRE-2000E)，滤过除菌膜(苏州优可发新材料科技有限公司，型号：YKF10018)，二氧化碳(培养箱(南北仪器有限公司，型号：CHP-80)，Nanodrop 2000仪器(Thermo Fisher公司，美国，型号：NanoDrop 2000C)，PCR仪(ABI公司，美国，型号：ABI7900)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 培养CCRF-CEM至对数生长期时，将细胞悬液的浓度调整为1×108/L，并接种到96孔培养板并分为对照组、观察组，于每孔中加入细胞悬液，容量190 μL，每组取平行孔6个，于饱和温度培养箱中、持续培养24 h。在观察细胞中，分别加入质量浓度为16 mg/L、80 mg/L、400 mg/L的川楝子醇提物10 μL；在对照组中，加三蒸水10 μL，置于与1.2.2条件相同的培养箱中，连续对其培养24 h、48 h、72 h。之后，于每个平行孔中加入20 μL的MTT，再放入培养箱中，持续4 h，之后进行离心处理，1 000 r/min，离心10 min，离心半径5.5 cm，弃去上清液，加150 μL的二甲基亚砜，以酶标仪测定各孔吸光度值。抑制率为2组吸光度之差与对照组吸光度的比值[7]。

调整对数生长期CCRF-CEM细胞浓度为1×108/L，灌入4个培养瓶(1瓶对照组、3瓶观察组)中，均为9.5 mL，一一标记后将其置于二氧化碳培养箱中，持续培养，共24 h，根据19:1的药液比，依次加入低、中、高质量浓度的川楝子醇提物，均0.5 mL，以使终质量浓度分别为16 mg/L、80 mg/L、400 mg/L，分别设定为16 mg/L川楝子醇提物组、80 mg/L川楝子醇提物组、400 mg/L川楝子醇提物组。对照组加入等体积三蒸水，对其持续培养24 h、48 h，收集细胞并进行离心沉淀，之后在沉淀中加裂解液300 μL，进行离心处理，持续10 min后可得蛋白液。进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE)、转膜后封闭2 h，再加入兔抗人单克隆一抗Bax、P53、Bcl-2，于4 ℃环境下孵育过夜，加山羊抗兔二抗，孵育2 h，加ECL发光液。分析条带吸光度值。

1.2.2 给药方法 取川楝子果实，洗净、晒干，用粉碎机打成粉末(约为40目)，以56 ℃的温度将其烘干，置于圆底烧瓶中，加体积分数为80%的乙醇持续浸泡24 h，回流提取、过滤，之后用旋转蒸发仪减压、回收溶剂，最终可得浸膏，使用100 mL乙酸乙酯萃取3次，以同样方法回收乙酸乙酯萃取剂，真空干燥，得棕褐色固体川楝子醇提物，置于4 ℃的冰箱中保存。取1.02 g川楝素、与6 mL三蒸水溶解，经0.22 μm滤过除菌膜进行过滤，得170 g/L的川楝子醇提物母液，置于4 ℃的冰箱中保存，以待使用。

于体积分数为10%的新生牛血清RPMI1640培养基中、接种CCRF-CEM悬液，将细胞浓度调整为1×108/L，置于CO2恒温培养箱(温度：37 ℃、体积分数：5%)培养，每3天对培养基进行1次更换，待细胞生长良好、处于对数生长期时行后续实验。

1.2.3 检测指标与方法 分析川楝子醇提物对CCRF-CEM的抑制作用，对CCRF-CEM凋亡的影响(川楝子醇提物作用CCRF-CEM 24 h、48 h后Bax、P53、Bcl-2基因表达)。使用TRIZOL试剂从1.2.1中的CCRF-CEM中提取总RNA，并使用Nanodrop 2000进行定量。使用RNeasy Mini试剂盒进行逆转录，使用SYBR Premix Ex TaqTM进行RT-qPCR：95 ℃下持续2 min，58 ℃下维持20 s，然后在72 ℃下反应20 s(该步骤40个循环)，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH)为内参，使用2-△△Ct法计算Bax、P53、Bcl-2的相对表达水平。

2 结果

2.1 川楝子醇提物对CCRF-CEM细胞生长的影响 16 mg/L、80 mg/L、400 mg/L川楝子醇提物作用CCRF-CEM的不同时间具有明显的抗增殖作用。相较于对照组，于同一时间点，不同质量川楝子醇提物的吸光度值明显不同，且随着质量的增加，吸光度值逐渐降低(P<0.05)。见表1。

表1 川楝子醇提物对CCRF-CEM生长的影响

2.2 川楝子醇提物对外周血淋巴细胞生长的影响 与对照组比较，16 mg/L、80 mg/L、400 mg/L川楝子醇提物作用外周血淋巴细胞同一时间段的给药吸光度值比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示不同质量浓度对外周血淋巴细胞无明显的不良反应。见表2。

表2 川楝子醇提物对外周血淋巴细胞生长的影响

2.3 川楝子醇提物对CCRF-CEM凋亡的影响 于同一时间点，与对照组比较，不同质量浓度川楝子醇提物的Bax、P53、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)基因表达明显不同(P<0.05)；Bax随质量浓度的增加而增加，Bcl-2基因表达随质量浓度的增加而降低，24 h 400 mg/L川楝子醇提物的P53基因表达达到最高，而作用于CCRF-CEM 48 h后，基因表达呈上升趋势(P<0.05)。见表3。

表3 分析川楝子醇提物对CCRF-CEM凋亡的影响

2.4 细胞形态学变化情况 倒置显微镜下发现，对照组患者的CCRF-CEM分布密度较高，大小一致，多有凸起。见图1A、图1B。加药24 h之后，随着川楝子浓度的增加，细胞出现了不同程度的体积减小、生成密度降低、折光性变差等情况。见图1C、图1D。加药48 h后，生长密度显著降低，细胞逐渐出现碎片。见图1E、图1F。

使用Giemsa染色，油镜下观察不同浓度川楝子醇提物作用于CCRF-CEM结构变化。对照组细胞可见大而圆的细胞核，胞浆甚少，细胞膜完整；加药24 h后，随着川楝子醇提物作用浓度的不断增加，作用时间延长至48 h，出现不同程度的细胞膜皱缩破损、染色质凝聚成块、核膜破裂。见图1G、图1H。

图1 不同组别细胞的形态学变化情况

3 讨论

白血病为一类造血干祖细胞的恶性克隆性疾病，白血病细胞大量增殖积累，抑制正常造血，并浸润其他器官组织，患者多见贫血、出血、感染、骨骼疼痛等症状，部分患者经积极有效的治疗后可缓解症状，延长生存时间，但若病情进展迅速，极易导致死亡[8-9]。化学疗法与造血干细胞移植等方法可在一定程度上缓解患者症状，改善病情，但化学疗法无法彻底杀灭癌细胞，易扩散，且不良反应多，异体移植排斥风险较高，治疗后复发率较高，对患者带来极大痛苦[10-11]。

在中医学中并无“白血病”称谓，依据患者临床表现、发病特点，可归为“虚劳”“热劳”“瘀积”“湿病”等范畴[12-13]。《圣济总录》曰：“热劳之证”，面赤、头痛、唇焦、食欲无味，多卧少起，日渐羸瘦者。《灵枢》中记载“人之善病肠中积聚者……皮肤薄而不泽”。中医治疗此病多在扶正固本的治则下彻底消除病灶，清热解毒，提高患者的抗癌能力，以起标本兼治的治疗效果。《中华人民共和国药典》中收录的有毒药物中，抗白血病药物10余种，有毒中药川楝子属于一种植物类，因其味苦，性寒，可归为理气类药物[14-15]。相关报道显示，川楝子的主要成分川楝素，对于胃癌SGC-7901细胞的生长可产生明显的抑制作用，可见明显的细胞凋亡特征，且作用机制极可能为通过线粒体介导诱导细胞凋亡[16-17]。

本研究结果表明，不同质量川楝子醇提物的吸光度值明显不同，且随着质量的增加吸光度值逐渐降低。提示川楝子提取物作用CCRF-CEM具有明显的抗增殖作用，且随着川楝子质量浓度的不断增加，其对CCRF-CEM的生长抑制效果越强，川楝子提取物对于CCRF-CEM的生长抑制作用，与其浓度、作用时间均呈正向关系[18-19]。

此外，研究还发现，不同质量浓度川楝子提取物的Bax、P53、Bcl-2基因表达明显不同；Bax表达随质量浓度的增加而增加，Bcl-2表达随质量浓度的增加而降低，24 h 400 mg/L川楝子醇提物的P53基因表达达到最高，而作用于CCRF-CEM 48 h后，基因表达呈上升趋势。观察细胞形态学变化情况发现，加药24 h之后，随着川楝子浓度的不断增加，细胞出现了不同程度的体积减小、生成密度降低、折光性变差等情况；加药24 h后，随着川楝子醇提物作用浓度的不断增加，作用时间延长至48 h，出现不同程度的细胞膜皱缩破损、染色质凝聚成块、核膜破裂。分析原因：恶性肿瘤细胞肆意生长主要与存在凋亡逃逸现象有关，若阻断此现象，需从细胞凋亡途径着手，而细胞凋亡主要包括内源性、外源性通路，二者间相互影响，但前者更重要[20-21]。内源性途径中Bax、Bcl-2等促凋亡因子具有十分重要的作用，Bax/Bcl-2比值下降时，一系列变化可形成“凋亡体”，从而可促使细胞凋亡。

综上所述，川楝子醇提物可有效抑制CCRF-CEM增殖，且可通过诱导线粒体介导的细胞凋亡实现浓度、时间依赖性，临床应用价值显著，值得推广。