反相高效液相色谱法测定土壤中多环芳烃

张会

（河北中天环保技术有限公司，河北 石家庄 050000）

0 引 言

多环芳烃是一类含有2 个或2 个以上苯环的碳氢化合物的总称，属于持久性有机污染物。迄今为止，人类已经发现200 多种多环芳烃，且相当数量的多环芳烃均具有致癌、致畸、致突变的“三致”特性，对环境的危害极大。

多环芳烃广泛存在于大气、水及土壤环境中，在多种环境介质中，土壤承担了＞90%的多环芳烃的环境负荷，且多富集在表层。

1976 年，在国际癌症研究中心（LARC） 列出的94 种对实验动物致癌的化合物中，其中15 种属于多环芳烃，农作物的营养积累主要通过吸收表层土壤中的养分来完成，所以，表层土壤中的多环芳烃通过生物转化等途径进入食物链，参与机体的代谢作用，对人体的生长、发育、神经及免疫系统产生毒副作用，从而诱发多种癌症。

美国环保署（EPA） 已经将16 种对环境影响大的多环芳烃确定为优先控制环境污染物，而其中的萘、等8 种多环芳烃，更是被我国确定为建设用地土壤污染风险管控中的基本项目。

多环芳烃测定结果的准确性关系到土壤环境质量调查结果的可靠性，关系到被调查土壤的污染程度，关系到被调查企业的生死存亡，还关系到被调查土地的利用类型，及对周围人群生存环境的影响。因此，提高土壤样品中多环芳烃测定的准确性至关重要。

长期以来，各检验检测机构对国产液相设备认可性较低，多环芳烃检测更崇尚使用专用柱。

我国液相色谱仪产品研发起步晚，相比进口设备其检测仪器的性能较差。因多环芳烃测定因子的较多，个别因子间分离度较差成为了各检验检测机构崇尚使用进口设备和多环芳烃专用柱的主要原因。

但进口设备价格昂贵，多环芳烃专用柱为易耗品，且价格不菲，使用国产液相设备及普通C18反相色谱柱准确检测土壤中多环芳烃，无疑是小检验检测机构降低成本的有效方法。

本文使用国产Agress D1100 高效液相色谱仪（紫外检测器） 及Supersil ODS2 5 μm C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，从设备条件设置方面着手，通过优化仪器设备条件，以提高多环芳烃测定的精密度和准确度，旨在证明国产液相设备及C18 反相色谱柱同样能够准确测定土壤中含有的多环芳烃。

1 主要仪器和试剂

1.1 仪 器

（1） Agress D1100 高效液相色谱仪。

（2） D1100 紫外检测器。

（3） EclassicalW3200 工作站。

（4） AgressD1100 柱温箱：大连依利特分析仪器有限公司。

（5） FA2004N 电子天平：上海菁海仪器有限公司。

（6） JL-180DT 脱气装置：上海吉理科学仪器有限公司。

（7） BSXT-02 索氏提取器：上海争巧科学仪器有限公司。

（8） C181 000 mg 6 mL 硅胶固相萃取柱：泰州康之达实验器材有限公司。

（9） LC-DCY-12G 氮吹浓缩仪：上海力辰邦西仪器有限公司。

（10） UPB-10 型高纯水机：石家庄泰斯特仪器设备有限公司。

1.2 试 剂

（1） 乙腈（CH3CN）：HPLC 级，安徽时联特种溶剂股份有限公司，批号为75-05-8。

（2） 正己烷（C6H14）：HPLC 级，天津市科密欧化学试剂，批号为20200310。

（3） 二氯甲烷（CH2Cl2）：HPLC 级，安徽时联特种溶剂股份有限公司。

（4） 丙酮（CH3COCH3）：HPLC 级，欧普森，批号为D9002。

（5） 石英砂：100 ～20 目，天津科密欧化学试剂，批号为20210110。

（6） 多环芳烃标准储备溶液：200 μg/mL，北京坛墨质检科技有限公司，批号为1032007。

（7） 十氟联苯标准贮备液（C12F10）：1 000 μg/mL，北京坛墨质检科技有限公司，批号为A2101107。

（8） 无水硫酸钠（Na2SO4）：天津市科密欧化学试剂，批号为20191203。

2 色谱条件

（1） 色谱柱：SUPERSIL ODS2 C18色谱柱，250 mm×4.6 mm，5 μm，大连依利特分析仪器有限公司。

（2） 进样量：20 μL。

（3） 柱温：35 ℃。

（4） 流动相A：乙腈；流动相B：水。

（5） 流速：1.0 mL/min。

梯度洗脱程序设置见表1。

表1 梯度洗脱程序设置Table 1 Gradient elution program setting

3 标准曲线绘制

用微量注射器移取适量的多环芳烃标准使用液，用乙腈稀释，配制成质量浓度为0.04、0.10、0.50、1.00、5.00 μg/mL 的标准系列。

移取50.0μL十氟联苯使用液加入到各标准系列中，使多环芳烃标准系列中十氟联苯的质量浓度为2.00μg/mL。

按照上述2 色谱条件，从低浓度到高浓度依次测定，以浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，建立标准曲线（标准曲线线性范围、线性方程、相关系数见表3）。

4 样品制备

4.1 土壤样品处理

4.1.1 样品中多环芳烃的提取（1） 除去样品中的树枝、石子等异物。

（2） 称取10 g（精确至0.01 g） 土壤样品，加入无水硫酸钠，研磨均化成流沙状。

（3） 将试样放入纸质套管内，加入50.0 μL十氟联苯使用液，放入索氏提取器中。

（4） 再在索氏提取器中加入100 mL 丙酮- 正己烷混合溶液，以≥4 次/h 的回流速度提取16 h，即得到提取液。

4.1.2 提取液脱水和浓缩

（1） 在玻璃漏斗中铺上玻璃纤维滤膜，并加入5 g 无水硫酸钠，将提取液过滤到浓缩容器中。

（2） 用丙酮- 正己烷混合溶液洗涤提取容器，并冲洗玻璃漏斗，合并洗液至浓缩容器中。

（3） 用干式氮吹仪氮吹溶液，浓缩至1 mL。4.1.3 提取液净化和溶剂转换

（1） 将浓缩后的提取液移入硅胶固相萃取柱中，用3 mL 正己烷分3 次洗涤浓缩器皿。

（2） 将溶液移入硅胶固相萃取柱中，用10 mL 二氯甲烷- 正己烷混合液进行洗脱。

（3） 将洗脱液经干式氮吹仪浓缩至1 mL。

（4） 在浓缩液加入3 mL 乙腈，再次经氮吹浓缩至＜1 mL。

（5） 用乙腈准确定容至1 mL，待测。

4.2 空白样品制备

称取10 g 石英砂代替土壤样品，按照与土壤样品处理的相同步骤，进行多环芳烃空白试样制备，得到净化液1 mL，待测。

4.3 空白加标样品制备

（1） 称取10 g（精确至0.01 g） 石英砂（代替土壤） 共14 份，分为A、B 两组，每组7 份。

（2） 分别将样品放入研磨器中进行研磨，然后，放入纸质套管内。A 组中每份加入8 μL 多环芳烃标准使用溶液（浓度为20 μg/mL）；B 组中每份加入10 μL 多环芳烃标准使用溶液（浓度为20 μg/mL）。

（3） 按照上述4.1 土壤样品处理的相同步骤，制备多环芳烃的空白加标试样，即得到1 mL 的净化液，待测。

4.4 土壤加标样品的制备

4.4.1 高浓度加标土壤样品

（1） 准确称取10 g（精确至0.01 g） 土壤样品，加无水硫酸钠，研磨均化成流沙状。

（2） 将试样放入纸质套管内，加入20 μL 多环芳烃标准储备溶液（浓度为200 μg/mL），按照上述4.1 土壤样品处理的相同步骤，制备加标试样，即得到1 mL 的净化液，待测。

4.4.2 中浓度加标土壤样品

（1） 准确称取10 g（精确至0.01 g） 土壤样品，加无水硫酸钠，研磨均化成流沙状。

（2） 将试样放入纸质套管内，加入10 μL 多环芳烃标准储备溶液（浓度为200 μg/mL），按照上述4.1 土壤样品处理的相同步骤，制备加标试样，即得到1 mL 的净化液，待测。

4.4.3 低浓度加标土壤样品

（1） 准确称取10 g（精确至0.01g） 土壤样品，加无水硫酸钠，研磨均化成流沙状。

（2） 将试样放入纸质套管内，加入3 μL 多环芳烃标准储备溶液（浓度为200 μg/mL），按照上述4.1 土壤样品处理的相同步骤，制备加标试样，即得到1 mL 的净化液，待测。

5 结果与讨论

5.1 检测器及检测波长的选择

由于16 种多环芳烃中苊烯不适宜用荧光检测器进行检测，故本实验采用紫外检测器进行多环芳烃的检测。

经资料查阅16 种多环芳烃及替代物十氟联苯的最大吸收波长范围为210 ～297 nm，经试验对比，本实验选择检测波长为220 nm，实验证明色谱峰较高，且所有组分均能较好地达到基线分离。

5.2 流动相的选择

甲醇的紫外截止波长为210 nm，乙腈的紫外截止波长为190 nm，甲醇的紫外截止波长距离检测波长较近，低浓度时基线波动较大，影响方法检出限，故本实验选择乙腈/水配比作为流动相。

本实验考察了3 个水平（60%、70%、80%）的乙腈体积分数对分离的影响：

（1） 当乙腈体积分数为60%时，分析时间需65 min。随着体积分数的增加，各组分的保留时间均缩短。

（2） 当乙腈体积分数为70%时，出峰时间比较理想，峰形对称性好，且分离完全，多环芳烃各组分在45 min 之内就能完全分离。

（3） 当乙腈体积分数为80%时，分析时间更短，但色谱峰出现重叠。

所以，选择流动相为乙腈∶水=70∶30。

5.3 流速影响

当流速太大时，各组份的保留时间均减小，导致色谱峰产生重叠；当流速太小时，分析时间长且拖尾，导致色谱峰扩宽。

本实验考察了0.8、1.0、1.5 mL/min 3 个流速，当流速为1.0 mL/min 时，出峰时间和峰形都比较理想。

5.4 温度的影响

保持恒定的柱温有利于色谱的重现性。柱温越高，出峰越快，柱效越高。但柱温增高，会使分离度降低，而温度太高，对色谱柱不利。

本实验考察了30 ℃、35 ℃、40 ℃3 个温度对检测结果的影响，16 种多环芳烃各相邻组分峰的分离度结果见表2。

表2 16 种多环芳烃各相邻组分峰的分离度Table 2 Resolution of adjacent component peaks of 16 kinds of polycyclic aromatic hydrocarbons

由表2 可以看出，当柱温为35 ℃时，不仅出峰时间较快，且相邻峰的分离度均达到了比较理想的效果。

5.5 方法的线性关系

在最优化的色谱条件下，考察了16 种多环芳烃在0.04～5.00 μg/mL 范围内的线性情况，16 种多环芳烃及替代物十氟联苯均得到了完全分离。

16 种多环芳烃的色谱如图1 所示。

图1 16 种多环芳烃的色谱图Fig.1 Chromatograms of 16 kinds of polycyclic aromatic hydrocarbons

由图1 可以看出，每种多环芳烃对应的峰面积与浓度的线性良好。

16 种多环芳烃的线性范围、线性方程和相关系数见表3。

表3 16 种多环芳烃的线性范围、线性方程和相关系数Table 3 Linear range,linear equation and correlation coefficient of 16 kinds of polycyclic aromatic hydrocarbons

5.6 方法检出限和测定下限

方法检出限和测定下限按照《环境监测分析方法标准制定技术导则》 HJ168-2020 附录A 要求进行。

本实验首先对4.2 中制备的空白样品进行检测，检测结果为未检出目标物质。

根据仪器响应（3 倍信噪比） 估计各多环芳烃的检出限为4 μg/kg。

取10 g 石英砂，按照估计检出限的4 倍对空白样品进行加标处理，得到7 份4.3 中的A 组空白加标测试样品，根据各组分检测结果计算其标准偏差，并按照公式（1） 计算方法检出限。

式中：S 为n 次测定的标准偏差；t 为当自由度为（n-1） 时，置信度为99%时的t 分布（单侧）。

经测定16 种多环芳烃中，除菲、荧蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[ghi]苝、茚并[1,2,3-cd]芘外，其他目标物样品的浓度均在3 ～5 倍计算出的方法检出限范围内。

调整空白加标样品浓度后，得到7 份4.3 中的B 组空白加标测试样品，根据各组分检测结果计算标准偏差，并计算方法检出限。经测定菲、荧蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[ghi]苝、茚并[1,2,3-cd]芘浓度均在3 ～5 倍计算出的方法检出限范围内。

实验表明方法检出限的测定结果有效，方法的检出限及测定下限（n=7） 见表4。

表4 方法的检出限及测定下限（n=7）Table 4 Detection limit and lower limit of determination of the method（n=7）

5.7 样品分析和加标回收率及精密度

为确定上述分析条件下定量分析的精密度和准确度，本次试验取某农田土壤实际样品进行了检测，经检测该土壤样品中多环芳烃各组分含量均低于方法检出限，十氟联苯回收率为93.8%～103%；制备该土壤样品高、中、低3 个浓度的加标样品，每个浓度的加标样品制备6 个，具体制备方法见4.4。

对制得的加标样品进行测定，根据测定结果计算标准偏差、相对标准偏差和加标回收率，结果见表5。

表5 土壤样品的加标回收率及测定结果的精密度Table 5 Recovery rate of soil samples and precision of determination results

续表

6 结 语

使用国产Agress D1100 高效液相色谱仪（紫外检测器） 及Supersil ODS2 5 μm C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），通过优化仪器设备条件，多环芳烃目标物分离效果良好，测定结果的精密度、准确度均能达到较高水平，能够满足土壤多环芳烃的测定要求。