不同发酵条件对李子多酚含量的影响研究

闫婧怡，郑静美，王军华，李维佳

（河北瑞龙生物科技有限公司，河北 石家庄 050000）

0 引 言

李子为蔷薇科李属植物，在河北省种植资源丰富，尤其是在晋州市总十庄镇有一万多亩李子种植基地，保定满城区也有几十万亩李子种植基地，年产量达百万吨，其他地区零星分布。李子果实中不仅含有丰富的营养物质，同时具有药用价值，李子含有多酚等生物活性物质，具有降低血糖、改善代谢、延缓衰老、抗癌症的作用。

目前，对李子多酚的提取基本都是鲜果粗加工为主，而近年来，利用发酵技术提高活性成分的含量是发酵技术研究的新方向。研究发现，使用酵母菌对发酵可以提高植物活性成分的含量。酵母菌发酵是一种保持与提高果蔬营养价值和风味的处理方式，通过酵母菌发酵提高李子活性成分含量的报道较少。本文以李子为原料，以汉逊德巴利酵母菌、马克斯克鲁维酵母菌株、谷胱甘肽酵母菌株、酿酒酵母及鲁氏酵母为发酵菌株，在单因素试验的前提下，以发酵前后李子多酚含量的变化为标准，通过微生物菌株的筛选及组合研究，筛选出提高发酵产物多酚含量的菌株及菌株组合。利用筛选出的微生物菌株，对微生物发酵条件进一步优化，进而找到最佳的发酵条件，为李子多酚的加工及应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

李子购自石家庄农贸市场。汉逊德巴利酵母菌株购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC2.1335。马克斯克鲁维酵母菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC1276。谷胱甘肽酵母菌株购自中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M205130。酿酒酵母中国微生物菌种保藏中心，CICC1928。鲁氏酵母购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC32899。

1.2 试 剂

试验中所用试剂见表1。

表1 试验中所用试剂Table1 Reagents used in the test

1.3 仪器与设备

实验中所用仪器见表2。

表2 实验中所用仪器Table 2 Instruments used in the experiment

1.4 实验方法

1.4.1 原材料预处理

对购回的李子进行挑选，挑选出无腐烂，无伤害，完整的果实，将其清洗干净，沥干、去核后，至于-40℃冰箱内冷冻保藏备用。

1.4.2 酵母菌菌悬液的制备

从市场上购买上述酵母菌菌株，将活化后的酵母菌菌株接入YPD 培养基，25 ℃培养48 h，然后4 000 r/min，离心10 min，用无菌生理盐水清洗沉淀菌落后溶于蒸馏水，配置成活菌数为2.6×109CFU/mL 的菌悬液。

1.4.3 标准曲线的制备

采用福林- 酚比色法测定李子多酚含量，以没食子酸计，在760 nm 处测定吸光值，根据吸光值的大小与没食子酸浓度的大小成正相关的关系，制作没食子酸标准曲线。

1.4.4 结果计算

式中：Q 为李子样品中多酚的含量，mg/g；X 为在李子多酚含量标准曲线中根据所测吸光值得出的李子多酚溶液的质量浓度，μg/mL；V 为李子样品定容的体积，mL；N 为样品稀释倍数；q 为李子样品的质量，g。

1.4.5 不同酵母菌菌株对李子多酚含量的影响

称取50 g 李子冻果共7 份，经解冻、破碎、打浆制成浆液，用NaOH 溶液调节pH 值至5，然后分别将汉逊德巴利酵母菌株、马克斯克鲁维酵母菌株、谷胱甘肽酵母菌株、酿酒酵母及鲁氏酵母酵母菌株的菌悬液按照5%体积比接种，25 ℃培养48 h，在保证其他发酵条件相同的情况下，采集发酵样品，测定发酵后多酚含量，设置李子浆液及不接种酵母菌的李子浆液作为对照，每组重复3 次，筛选出获得能够提升李子多酚含量的酵母菌菌株。

1.4.6 发酵酵母菌菌株的组合对李子多酚含量的影响

将优选出的酵母菌菌株的菌悬液以相同菌数配比两两组合后，称取50 g 李子冻果共4 份，经解冻、破碎、打浆制成浆液，用NaOH 溶液调节pH值至5，将组合后的酵母菌菌悬液按照5%体积比接种，25 ℃培养48 h，在保证其他发酵条件相同的情况下，采集发酵样品，测定发酵后多酚含量，设置不接种酵母菌的李子浆液作为对照，每组重复3 次，测定李子发酵物中的多酚含量，筛选出能够提升多酚含量的酵母菌菌株组合。

1.4.7 李子多酚发酵的单因素试验

1.4.7.1 酵母菌菌株配比对李子多酚提取量的影响

将优选出的酵母菌菌株分别按照1∶4、1∶2、1∶1、1∶2、1∶4 的比例进行组合，称取50 g 李子冻果共5 份，经解冻、破碎、打浆制成浆液，用NaOH 溶液调节pH 值至5，将组合后的酵母菌菌悬液按照5%体积比接种，25 ℃培养48 h，在保证其他发酵条件相同的情况下，每组重复3 次，测定李子发酵物中的多酚含量，筛选出酵母菌菌株组合的最佳配比。

1.4.7.2 酵母菌接种量对李子多酚提取量的影响

将优选出的酵母菌菌株按照最佳配比组合，称取50 g 李子冻果共5 份，经解冻、破碎、打浆制成浆液，用NaOH 溶液调节pH 值至5.0，将组合后的酵母菌菌悬液分别按照1%、3%、5%、7%和9%的体积比接种，25℃培养48 h，在保证其他发酵条件相同的情况下，每组重复3 次，测定李子发酵物中的多酚含量，筛选出能够显著提升多酚含量的酵母菌接种量。

1.4.7.3 温度对李子多酚提取量的影响

将优选出的酵母菌菌株按照最佳配比组合，称取50 g 李子冻果共5 份，经解冻、破碎、打浆制成浆液，用NaOH 溶液调节pH 值至5.0，将组合后的酵母菌菌悬液分别最佳接种量接种，分别在22℃、25℃、28℃、31℃及34℃培养48 h，在保证其他发酵条件相同的情况下，每组重复3 次，测定李子发酵物中的多酚含量，筛选出能够显著提升多酚含量的菌母菌发酵温度。

1.4.7.4 pH 对李子多酚提取量的影响

将优选出的酵母菌菌株按照最佳配比组合，称取50 g 李子冻果共5 份，经解冻、破碎、打浆制成浆液，用NaOH 溶液分别调节pH 值至4.6、5.0、5.4、5.8 及6.2，将组合后的酵母菌菌悬液按照最佳接种量接种，在优选温度下培养48 h，在保证其他发酵条件相同的情况下，每组重复3 次，测定李子发酵物中的多酚含量，筛选出能够显著提升多酚含量的酵母菌发酵pH。

1.4.8 正交试验设计

根据上述单因素条件筛选的试验结果，利用正交分析法设计发酵法提李子多酚的实验方法，选取菌株配比、接种量、温度和pH 为影响李子多酚的发酵优化的因素，设计L9（34） 正交表，优化工艺参数，评估各单因素对发酵物中李子多酚含量影响的主次作用，确认最佳工艺条件。

自变量选取菌株配比、接种量、温度和pH，分别用A、B、C 和D 表示，用1、2、3 分别代表3 个水平，正交试验因素水平表见表3。

表3 正交试验设计因素及水平Table 3 Orthogonal test design factors and levels

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

采用福林- 酚比色法，绘制没食子酸标准曲线如图1 所示。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Gallic acid standard curve

没食子酸标准曲线回归方程：Y＝0.001 45x+0.019 38，R2＝0.995 99。

2.2 酵母菌发酵对李子多酚含量影响

2.2.1 不同酵母菌株对李子多酚含量的影响

不同酵母菌株对李子多酚含量的影响如图2 所示。与发酵对照组相比，经汉逊德巴利酵母、马克斯克鲁维酵母和谷胱甘肽酵母发酵后，发酵物中李子多酚含量有所提高，而经酿酒酵母发酵后，发酵物中李子多酚含量变化不明显，而经过鲁氏酵母发酵后，发酵物中李子多酚含量有所降低。最终，选取汉逊德巴利酵母、马克斯克鲁维酵母及谷胱甘肽酵母做为后续发酵的酵母菌菌株。

图2 不同酵母菌株对李子多酚含量的影响Fig.2 Effect of different yeast strains on the polyphenol content of plums

2.2.2 酵母菌株组合对李子多酚含量的影响

酵母菌株组合对李子多酚含量的影响如图3 所示，与发酵对照组相比，经汉逊德巴利酵母菌株马克斯克鲁维酵母菌株组合、汉逊德巴利酵母菌株与马克斯克鲁维酵母菌株组合、汉逊德巴利酵母菌株与谷胱甘肽酵母菌株组合发酵后，发酵物中的李子多酚含量均有提高，其中，经汉逊德巴利酵母与马克斯克鲁维酵母菌株发酵后，发酵物中李子多酚含量提高最多，因此选取汉逊德巴利酵母与马克斯克鲁维酵母菌株用于后续单因素试验。

图3 酵母菌株组合对李子多酚含量的影响Fig.3 Effect of yeast strain combinations on the polyphenol content of plums

2.3 单因素实验结果分析

2.3.1 酵母菌菌株配比对李子多酚提取量的影响

酵母菌菌株配比对李子多酚提取量的影响如图4 所示，随着汉逊德巴利酵母与马克斯克鲁维酵母中汉逊德巴利酵母菌株比例的的增加，发酵物中李子多酚含量有所增加，但是当汉逊德巴利酵母菌株与马克斯克鲁维酵母菌株配比超过2∶1 时，发酵物中李子多酚含量有下降的趋势，因此，汉逊德巴利酵母与马克斯克鲁维酵母菌株的菌株配比应控制在2∶1 左右。

图4 酵母菌菌株配比对李子多酚提取量的影响Fig.4 Effect of yeast strain ratios on the extraction of polyphenols from plums

2.3.2 酵母菌接种量对李子多酚提取量的影响

酵母菌接种量对李子多酚提取量的影响如图5所示，汉逊德巴利酵母与马克斯克鲁维酵母菌株组合接种量的从1%增加到7%，发酵物中李子多酚含量有着明显的提高，当接种量增加到7%时，多酚含量达到4.669 mg/g，当接种量超过7%时，发酵物中李子多酚含量有下降的趋势，因此，汉逊德巴利酵母与马克斯克鲁维酵母菌株的接种量应控制在7%左右。

图5 酵母菌接种量对李子多酚提取量的影响Fig.5 Effect of yeast inoculum on the extraction amount of plum polyphenols

2.3.3 发酵温度对李子多酚提取量的影响

发酵温度对李子多酚提取量的影响如图6 所示，发酵温度在22 ～31 ℃时，发酵物中李子多酚含量逐渐上升，当发酵温度到达31 ℃时，李子多酚含量达到最大4.824 mg/g，当发酵温度超过31℃时，发酵物中李子多酚含量有明显下降，可能的原因是发酵温度过高影响了菌株的活性。因此，汉逊德巴利酵母与马克斯克鲁维酵母菌株的发酵温度应控制在31 ℃左右。

图6 发酵温度对李子多酚提取量的影响Fig.6 Effect of fermentation temperature on the extraction amount of plum polyphenols

2.3.4 发酵pH 对李子多酚提取量的影响

发酵pH 对李子多酚提取量的影响如图7 所示，发酵pH 在4.6 ～5.4 时，发酵物中李子多酚含量逐渐上升，当发酵pH 为5.4 时，李子多酚含量达到最大4.992 mg/g，当发酵pH 超过5.4 时，发酵物中李子多酚含量有明显下降。因此，汉逊德巴利酵母与马克斯克鲁维酵母菌株的发酵pH 应控制在5.4 左右。

图7 发酵pH对李子多酚提取量的影响Fig.7 Effect of fermentation pH on the extraction amount of plum polyphenols

2.4 正交试验法优化结果

根据实验设计得出的实验结果见表4。

表4 正交试验设计与数据分析Table 4 Orthogonal test design and data analysis

由正交试验结果可知，影响发酵物中李子的多酚含量的的因素主次关系为D＞B＞C＞A，即4 个因素中对发酵物中李子的多酚含量影响最大的为pH，其他依次是接种量、温度和菌株配比。各因素的最佳的水平组合为A2B2C3D2，即汉逊德巴利酵母与马克斯克鲁维酵母菌菌株配比为2∶1，接种量为7%，发酵pH 值为5.4，发酵温度为31 ℃的条件下，李子发酵物中的多酚含量最高。

3 结 语

本文以李子为原料，通过对汉逊德巴利酵母菌株、马克斯克鲁维酵母菌株、谷胱甘肽酵母菌株、酿酒酵母及鲁氏酵母酵母菌株酵母菌菌株的筛选，筛选出了可以提高李子多酚含量的汉逊德巴利酵母菌株、马克斯克鲁维酵母菌株和谷胱甘肽酵母菌株。通过两两组合，优选出汉逊德巴利酵母菌株和马克斯克鲁维酵母菌株作为后续发酵工艺优化的菌株组合。通过单因素实验法，并采用正交试验法优化了发酵工艺，通过酵母菌发酵后，李子多酚的含量明显提高，优化后的发酵条件为汉逊德巴利酵母与马克斯克鲁维酵母菌菌株配比为2∶1，接种量为7%，发酵pH 值为5.4，发酵温度为31 ℃。本研究为李子多酚产品的进一步开发和资源利用提供了依据。