牛膝药材的红外指纹图谱建立及多元统计分析

2022-02-07 10:46贾豪雷益铭张维方雷敬卫杨春静李莹莹谢彩侠
中国药房 2022年2期
关键词:牛膝正态分布光谱

贾豪 雷益铭 张维方 雷敬卫 杨春静 李莹莹 谢彩侠

中图分类号 R284 文献标志码 A 文章编号 1001-0408(2022)02-0153-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.02.05

摘 要 目的 建立不同产地牛膝药材的红外指纹图谱,并进行多元统计分析。方法 采用Spectrum for Window 3.02和OMNIC 9.2软件建立61批牛膝药材样品的红外指纹图谱;以红外指纹图谱共有峰的相对峰高为变量,采用Excel 2016软件进行正态分布分析,采用SPSS 22.0软件进行聚类分析和主成分分析并计算综合得分,采用SIMCA 14.1软件进行正交偏最小二乘法-判别分析,以变量重要性投影(VIP)>1为标准,筛选影响牛膝药材成分质量的标志性波数。结果 61批牛膝药材样品红外光谱图的相关系数为0.967 2~0.997 7;共有13个共有峰。正态分布分析结果显示,河南产与河北产牛膝药材共有峰相对峰高的正态分布曲线未有交叉,河南产与内蒙古产牛膝药材的正态分布曲线存在交叉。聚类分析结果显示,当组间距离为15时,61批牛膝药材样品可聚为3类,其中N1~N12聚为一类,N13~N45聚为一类,N46~N61聚为一类。主成分分析结果显示,前3个主成分的累计方差贡献率为91.121%;河南省焦作市驾步村产牛膝药材(编号N40)的综合评分最高(2.39),河北省安國市新安村产牛膝(编号N4)的综合评分最低(-2.89)。正交偏最小二乘法-判别分析结果显示,61批牛膝药材样品可分为3类,其中N1~N12为一类,N13~N28为一类,N29~N61为一类;共筛选出7个影响药材样品质量的标志性波数,其VIP值从大到小对应的波数依次为1 059、927、2 933、813、1 732、1 128、3 367 cm-1,其中1 732 cm-1处为皂苷类成分的特征吸收峰,1 059、1 128、927 cm-1处为糖苷类成分的特征吸收峰。结论 红外指纹图谱结合正态分布分析、聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘法-判别分析可用于鉴别不同产地牛膝药材。

关键词 牛膝;红外指纹图谱;正态分布分析;聚类分析;主成分分析;正交偏最小二乘法-判别分析;产地

Establishment of infrared fingerprints and multivariate statistical analysis of Achyranthes bidentata

JIA Hao1,2,LEI Yiming3,ZHANG Weifang1,2,LEI Jingwei1,2,YANG Chunjing2,4,LI Yingying1,2,XIE Caixia1,2       (1. School of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China; 2. Henan Provincial Engineering Technology Research Center for TCM Quality Control and Evaluation, Zhengzhou 450046, China; 3. College of Orthopedics and Traumatology, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China; 4. Section of Clinical Pharmacy, Pharmacy Department, the Third Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China)

ABSTRACT   OBJECTIVE To establish the infrared fingerprints of Achyranthes bidentata from different producing areas, and to conduct multivariate statistical analysis. METHODS The infrared fingerprints of 61 batches of A. bidentata samples were established by Spectrum for Window 3.02 and OMNIC 9.2 software. Taking the relative peak height of common peaks of infrared fingerprint as the variable, the normal distribution analysis was carried out by Excel 2016 software; SPSS 22.0 software was used for cluster analysis and principal component analysis, and the comprehensive score was calculated; the orthogonal partial least squares-discriminant analysis was carried out by SIMCA 14.1 software, and the marker wave numbers affecting the quality of A. bidentata were screened by taking the variable importance in projection (VIP) >1 as the standard. RESULTS The correlation coefficients of infrared spectra of 61 batches of A. bidentata samples were 0.967 2-0.997 7; there were 13 common peaks. The results of normal distribution analysis showed that the normal distribution curve of relative peak height of common peaks for A. bidentata from Henan and Hebei did not cross, and the normal distribution curve of A. bidentata from Henan and Inner Mongolia crossed. The results of cluster analysis showed that when the distance between groups was 15, 61 batches of A. bidentata samples could be clustered into 3 categories, including N1-N12 were clustered into one category, N13-N45 were clustered into one category, and N46-N61 were clustered into one category. The results of principal component analysis showed that the cumulative variance contribution rate of the first three principal components was 91.121%; comprehensive score of A. bidentata (number N40) in Jiabu village, Jiaozuo City, Henan Province was the highest (2.39), and that of A. bidentata (number N4) in Xin’an village, Anguo City, Hebei Province was the lowest (-2.89). The results of orthogonal partial least squares-discriminant analysis showed that 61 batches of A. bidentata samples were divided into three categories, including N1-N12 were clustered into one category, N13-N28 were clustered into one category and N29-N61 were clustered into one category. Seven marker wave numbers affecting the quality were selected. The corresponding wave numbers of VIP from large to small were 1 059, 927, 2 933, 813, 1 732, 1 128 and 3 367 cm-1, 1 732 cm-1 was the characteristic obsorption peak of saponins,1 059, 1 128, 927 cm-1 were the characteristic obsorption peaks of glycosides. CONCLUSIONS Infrared fingerprint combined with normal distribution analysis, cluster analysis, principal component analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis can be used to identify A. bidentata from different producing areas.

KEYWORDS   Achyranthes bidentata; infrared fingerprint; normal distribution analysis; cluster analysis; principal component analysis; orthogonal partial least squares-discriminant analysis; producing areas

牛膝始载于《神农本草经》,为苋科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根[1],具有补肝肾、强筋骨、活血化瘀的功效,常用于临床治疗高血压、冠心病、心绞痛、哮喘等[2]。牛膝主要含有皂苷类、甾酮类、多糖类等化合物[3],具有抗生育、抗肿瘤、抗衰老、抗炎及抗骨质疏松等药理作用[4-5]。因牛膝产于古怀庆府(今河南焦作一带),为河南四大怀药之一,故又称为怀牛膝[6]。目前,我国已形成三大牛膝产区,即内蒙古赤峰、河北安国和河南焦作[7]。

关于牛膝的研究主要集中在β-蜕皮甾酮、人参皂苷Ro等成分的含量测定,高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的建立以及炮制工艺的优化等方面[8-12]。2020年版《中国药典》(一部)规定采用薄层色谱法对牛膝中β-蜕皮甾酮和人参皂苷Ro进行鉴别,采用HPLC法对牛膝中β-蜕皮甾酮进行含量测定[13]。但由于牛膝药材的化学成分复杂,仅对单一成分进行定量分析,具有一定的局限性;加之HPLC法多成分检测的成本较高,方法建立及测试费时、操作繁琐,所需流动相(甲醇、乙腈等)具有一定的毒性,应用受限[14]。红外光谱法具有灵敏度高、特征性强、检测快速、无损等特点[15],同时该法具有一定的整体性、客观性和科学性,既能反映药材内部所有复杂成分峰的叠加,又能反映药材所含不同成分及其比例,故可全面体现药材的质量[16]。随着红外光谱技术的发展,其分辨率及图谱识别能力均有了新的突破,已成为中药快速鉴别及质量评价的一种有效手段[17-19]。美日韩等国药典均已将红外光谱技术作为药物鉴定的重要方法[20]。化学模式识别分析可以数字化地表达光谱信息,其结合红外光谱能更加客观地评价中药材的质量[21]。基于此,本研究建立了上述三大产地牛膝药材的红外指纹图谱,同时结合化学模式识别进行分析,旨在为快速鉴别牛膝提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有Spectrum 100型傅里叶变换红外分光光度计、Spectrum for Window 3.02软件(美国Pekin Elmer公司),FW-4A型粉末压片机(天津市拓普仪器有限公司),FW-100型高速万能粉碎机、101-3AB型点热恒温鼓风干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公司),ME204E/OL型万分之一天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]等。

1.2 主要药品与试剂

25S-牛膝甾酮对照品(批号3737,纯度≥98.0%)、25R-牛膝甾酮对照品(批号3736,纯度≥98.0%)、竹节参皂苷Ⅳa对照品(批号2665,纯度≥98.0%)、β-蜕皮甾酮对照品(批号1889,纯度≥98.0%)均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司;溴化钾(光谱纯,批号C12045707)购自天津市科密欧化学试剂有限公司;无水乙醇(分析纯,批号20210720)购自天津市致远化学试剂有限公司;水为纯净水。

牛膝药材共61批(编号N1~N61),其中N1~N12购自河北省安国市药材市场,N13~N28购自内蒙古自治区赤峰市药材市场,N29~N61采自河南省焦作市牛膝产地。所有药材经河南中医药大学药学院陈随清教授鉴定,均为苋科植物牛膝A. bidentata Bl.的干燥根。取牛膝药材,除去须根、泥沙,捆成小把,晒至干皱,将顶端切齐,晒干后,用水润透,除去残留芦头,于55 ℃烘干,粉碎,过200目筛,用自封袋密封,保存至干燥器,备用。61批牛膝药材样品的来源信息见表1。

2 方法与结果

2.1 红外光谱的建立

2.1.1 样品片的制备 取牛膝药材样品粉末2 mg,加入干燥溴化钾200 mg,研磨,混匀;取混合均匀的样品适量,置于专用压片模具中,以8 MPa压制30 s,得均匀半透明的薄片,即供试样品片。同法制备溴化钾空白片和各对照品样品片。

2.1.2 测定条件 光谱扫描范围为400~4 000 cm-1,扫描前扣除CO2和H2O的干扰,扫描次数为16次/s,扫描速度为0.2 cm/s,光谱分辨率为4 cm-1,实验室温度为20~25 ℃,相对湿度为25%~35%。

2.1.3 精密度试验 取牛膝药材样品(编号N1)粉末,按“2.1.1”项下方法制备供试样品片,按“2.1.2”项下条件连续测定6次,将所得红外光谱图导入OMNIC 9.2软件。结果显示,红外光谱图的相关系数为0.997 2~0.997 4(n=6),表明方法精密度良好。

2.1.4 重復性试验 取牛膝药材样品(编号N1)粉末,共6份,按“2.1.1”项下方法制备供试样品片,按“2.1.2”项下条件测定,将所得红外光谱图导入OMNIC 9.2软件。结果显示,红外光谱图的相关系数为0.995 5~0.998 1(n=6),表明方法重复性良好。

2.1.5 稳定性试验 取牛膝药材样品(编号N1)粉末,按“2.1.1”项下方法制备供试样品片,分别于室温下放置0、30、60、90、120、150 min时按“2.1.2”项下条件测定,将所得红外光谱图导入OMNIC 9.2软件。结果显示,红外光谱图的相关系数为0.991 3~0.997 4(n=6),表明样品在室温下放置150 min内稳定性良好。

2.1.6 红外光谱数据分析 取61批牛膝药材样品粉末,按“2.1.1”项下方法制备供试样品片,按“2.1.2”项下条件测定,采用Spectrum for Window 3.02软件采集上述药材样品的红外光谱图,得到61批牛膝药材的红外指纹图谱,采用OMNIC 9.2软件计算红外光谱图的相关系数。结果显示,61批牛膝药材样品红外光谱图的相关系数为0.967 2~0.997 7;所得红外光谱图的峰形、峰位、峰高基本相似,表明不同产地牛膝药材中含有相似的化学成分,所含特征峰及其形状基本一致,但指纹区(400~1 350 cm-1)存在一定差异。结果见图1。

采用OMNIC 9.2软件将61批牛膝药材样品的红外光谱图进行平均处理后将透过率转化为吸光度,得到不同产地牛膝药材的平均红外光谱图,详见图2。由图2可知,61批牛膝药材样品共有13个共有峰。在3 367 cm-1附近强而宽的吸收峰为多糖类、皂苷类、甾酮类化合物中的O—H伸缩振动峰。2 933 cm-1处的吸收峰为—CH2不对称伸缩振动峰,结合1 420、1 332 cm-1附近的C—H弯曲振动峰,表明牛膝药材所含成分具有较多的饱和烷基。1 732 cm-1附近的吸收峰是羧酸类及酯类等化合物中的C=O伸缩振动峰;1 638 cm-1处的吸收峰为水分子O—H弯曲振动峰、酰胺基N—H弯曲振动峰、共轭羰基C=O伸缩振动峰;1 259 cm-1处的吸收峰可能是C—H弯曲振动和C—O伸缩振动的叠加峰,主要包括多糖类、糖苷类、脂类成分中的C—O和C—O—C不对称伸缩振动峰;1 128、1 059、1 027、927 cm-1附近的吸收峰为糖类、糖苷类等成分中的C—O伸缩振动峰。有研究表明,牛膝中主要含有皂苷类、甾酮类、多糖类等成分[7]。现分离得到的三萜皂苷类成分主要为以齐墩果酸为苷元的皂苷类成分(如竹节参皂苷Ⅳa、牛膝皂苷Ⅰ、牛膝皂苷Ⅱ等)和甾酮类成分(如β-蜕皮甾酮、25S-牛膝甾酮、25R-牛膝甾酮等)[5]。

采用OMNIC 9.2软件将牛膝药材样品和各对照品样品片的红外光谱图进行平均处理后,得到牛膝药材与各对照品的平均红外光谱图,详见图3。由图3可知,在1 732 cm-1处为皂苷类成分的特征吸收峰,1 638 cm-1处为甾酮类成分的特征吸收峰。

2.2 正态分布分析

采用Spectrum for Window 3.02软件,以1 027 cm-1附近最强吸收峰的吸光度(采用Spectrum for window 3.02软件将透过率转化为吸光度)为参照,对共有峰峰高进行归一化处理,得到13个共有峰的相对峰高,详见图4(因3 367、2 933 cm-1处主要为O—H与—CH2的吸收峰且为强吸收峰,1 700~1 900 cm-1波段主要为酯类成分、1 500~1 700 cm-1波段主要为酸类成分、950~1 200 cm-1波段主要为糖类成分,其余5个波数为牛膝药材红外光谱中的强吸收峰且在上述3个波段内,故选择图中的7个共有峰进行分析)。由图4可知,2 933、1 732、1 638 cm-1这3个波数能将3个不同产地牛膝药材样品区分开来。进一步去除1 732、1 638 cm-1处吸收峰相对峰高的离散值(相对峰高与均值相差的较大值)后,计算1 732、1 638 cm-1处吸收峰的相对峰高比值,采用Excel 2016软件,以不同产地牛膝药材样品1 732、1 638 cm-1处吸收峰的相对峰高比值为横、纵坐标绘制正态分布曲线,详见图5。由图5可知,河南产与河北产牛膝药材的正态分布曲线未有交叉,表明两地牛膝药材样品质量存在明显差异;河南产与内蒙古产牛膝药材的正态分布曲线存在交叉,表明两地牛膝药材样品质量相近。

2.3 聚类分析

以61批牛膝药材样品中13个共有峰的相对峰高为原始数据,采用组间连接法以平方Euclidean距离为分类依据,采用SPSS 22.0软件进行聚类分析,详见图6。由图6可知,当组间距离为10时,61批牛膝药材样品可聚为4类,其中N1~N12聚为一类,N13~N18、N36~N45聚为一类,N19~N35聚为一类,N46~N61聚为一类;当组间距离为15时,可聚为3类,其中N1~N12聚为一类,N13~N45聚为一类,N46~N61聚为一类;当组间距离为20时,可聚为两类,其中N1~N12聚为一类,N13~N61聚为一类,聚类分析结果与正态分布分析结果基本一致。

2.4 主成分分析

主成分分析是在尽可能保持原有数据信息的前提下,通过降维处理达到简化指标的目的,目前已被广泛用于数据统计分析[22]。以61批牛膝药材样品中13个共有峰的相对峰高为原始数据,采用SPSS 22.0软件进行主成分分析。结果显示,前3个主成分的累计方差贡献率为91.121%(>85%),表明前3个主成分可以反映牛膝药材样品中13个共有峰的基本特征和主要信息,故选取特征值大于1的前3个主成分进行后续分析。结果见表2、图7。

采用SPSS 22.0软件计算3个主成分的得分,以各主成分的方差贡献率为权重,对主成分得分和对应权重进行加权平均,得综合得分:综合得分=(56.383×主成分1+24.735×主成分2+10.003×主成分3)/91.121。综合得分可反映牛膝药材的质量,综合得分越高,表示质量越好[23]。61批牛膝药材中,河南省焦作市驾步村产牛膝药材(编号N40)的综合得分最高,河北省安国市新安村产牛膝药材(编号N4)的综合得分最低。结果见表3。

2.5 正交偏最小二乘法-判别分析

为分析样品组间差异性,以61批牛膝药材样品中13個共有峰的相对峰高为原始数据,采用SIMCA 14.1软件进行正交偏最小二乘法-判别分析。结果显示,数据矩阵的解释率参数(R 2X)=0.986,模型区分参数(R 2Y)=0.943,模型预测能力参数(Q 2)=0.932,均大于0.5,表明模型拟合程度较好,具有较高的稳定性和预测能力[24]。在95%置信区间(confidence interval,CI)内牛膝药材样品存在一定的差异性,可将61批牛膝药材样品分为3类,其中N1~N12位于得分图的右侧,为一类;N13~N28位于得分图的左下侧,为一类;N29~N61位于得分图左上侧,为一类。结果见图8。

变量重要性投影(variable importance in projection,VIP)可衡量各共有峰的表达模式对样本分类判别的影响强度和解释能力,从而辅助筛选影响质量差异的标志性波段[25]。以VIP>1为标准[26]筛选影响牛膝药材质量的标志性波段,且在95%CI内,VIP值越大,表示质量差异越显著,对区别不同产地牛膝药材的贡献越大[27]。结果显示,共筛选出7个影响牛膝药材质量的关键波数,其VIP从大到小对应的波数依次为1 059、927、2 933、813、1 732、1 128、3 367 cm-1,其中1 732 cm-1处为皂苷类成分的特征吸收峰,1 059、1 128、927 cm-1处为糖苷类成分的特征吸收峰。结果见图9。

3 讨论

“药王”孙思邈在《备急千金要方》中云:“古之医者……用药必依土地,所以治十得九。”[28]由此可见,产地因素对药材品质有一定的影响。不同产地的温度、湿度、降水量、风速、地形、土壤、微生物等因素均会通过影响药材的物候规律和生长发育、能量代谢、物质合成及气体交换等生理过程,进而影响其有效物质(次生代谢产物)的生成,继而导致不同产地牛膝中三萜皂苷类、甾酮类、多糖类等有效成分含量各有不同,最终引起药材质量及临床疗效的差异[29]。

有研究认为,红外光谱图中1 700~1 900 cm-1波段主要为酯类成分、1 500~1 700 cm-1波段主要为酸类成分、950~1 200 cm-1波段主要为糖类成分,这些初级代谢产物在相应波段范围内的振动吸收均有差别[30]。本研究结果显示,河南产牛膝药材中2 933、1 732、1 638 cm-1处吸收峰的相对峰高均高于内蒙古产和河北产牛膝药材。因此,笔者认为,可将这3个波数对应吸收峰的相对峰高用于区分不同产地牛膝药材。

正态分布分析结果显示,河南产与河北产牛膝药材的正态分布曲线未有交叉,表明两地牛膝药材样品质量存在明显差异;河南产与内蒙古产牛膝药材的正态分布曲线存在交叉,表明两地牛膝药材样品质量相近。聚类分析结果显示,当组间距离为15时,61批牛膝药材可聚为3类,其中N1~N12聚为一类、N13~N45聚为一类、N46~N61聚为一类。主成分分析结果显示,前3个主成分的累计方差贡献率为91.121%;河南省焦作市驾步村产牛膝药材(编号N40)的综合得分最高,河北省安国市新安村产牛膝药材(编号N4)的综合得分最低。以上结果表明,河南产牛膝与内蒙古产牛膝的质量相似,均与河北产牛膝存在一定差异。

正交偏最小二乘法-判别分析结果显示,61批牛膝药材样品分为3类,其中N1~N12位于得分图的右侧,为一类;N13~N28位于得分图的左下侧,为一类;N29~N61位于得分图左上侧,为一类,表明不同产地牛膝药材质量具有一定差异。共筛选出7个影响牛膝药材质量的标志性波数,VIP从大到小对应的波数依次为1 059、927、2 933、813、1 732、1 128、3 367 cm-1,其中1 732 cm-1处为皂苷类成分的特征吸收峰,1 059、1 128、927 cm-1处为糖苷类成分的特征吸收峰。

综上所述,红外指纹图谱结合正态分布、聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘法-判别分析可用于鉴别不同产地牛膝药材;不同产地牛膝药材质量存在一定差异。

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(收稿日期:2021-08-21 修回日期:2021-12-07)

(編辑:陈 宏)

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