磷胁迫下内生真菌对米老排生长和磷素吸收的影响

沈 雯 ，邹秉章，林能庆，代甜甜，林 晗 ，洪永辉，林景泉，谢安强

（1.福建农林大学林学院，福建 福州 350002；2.福建省高校森林生态系统经营与过程重点实验室，福建 福州 350002；3.福建省上杭白砂国有林场，福建 龙岩 364200；4.龙岩市林业种苗站，福建 龙岩 364200）

【研究意义】米老排（Mytilaria laosensis）是一种常见的速生树种，主要在东南亚国家和我国西南、东南等地区广泛种植，具有良好的经济价值、生态价值和观赏价值［1］，同时也是土壤改良、水土保持、混交造林、水源涵养和生物防火的优良树种，是我国重要的阔叶树种和速生树种之一［2］。米老排作为一种快速生长的高大阔叶树，在土壤保护和管理方面发挥着重要作用，其大规模种植有助于增加生态效益。米老排在我国一般生长在南方酸性土壤中，以沙岩、花岗岩等酸性红壤土为主。南方土壤的弱酸性和低磷特点造成米老排等南方树种质量和产量下降［3］。近年来，随着人们对木材需求量的不断增大，科研工作者发现米老排具有巨大的发展潜力和利用价值，因此，有关米老排树种的研究工作在不断加强和深入。【前人研究进展】磷在植物生长和发育过程中发挥重要作用，参与植物体内的许多生化过程［4］以及信号传递，对植物生长发育和提高抗逆性有着显著促进作用。研究表明，缺磷会抑制植物的正常生长发育。然而，为适应低磷胁迫环境，大多数植物会通过增加根部酸性磷酸酶等渗出物的方式，以减轻对植物生长发育的抑制作用。此外，为避免低磷胁迫下植株体内活性氧自由基的过度累积而产生的损伤，植物会提升超氧化物歧化酶等保护酶的活性来降低低磷胁迫所导致的氧化损伤［5-6］。在我国南方林区，土壤磷素矿化现象很普遍，阻碍了磷的有效利用［7-8］，严重限制了农林植物的正常生长发育。【本研究切入点】内生真菌是指生活在健康植株不同组织和器官中的微生物，不会对植株产生明显病害症状［9-10］。有研究表明内生真菌可以合成并分泌植株生长所需要的生长素IAA、赤霉素GA 等植物激素，也可以促进植株对营养元素的吸收，促进植株生长。内生真菌对植株的光合特性具有积极影响，能够提高植株抗生物和非生物的胁迫能力［11-13］。目前，关于采用内生真菌促进米老排幼苗生长和磷元素吸收的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】本研究以一年生米老排实生幼苗作为供试材料，土壤设置不同浓度的磷胁迫，开展内生真菌对米老排幼苗生长和磷素吸收的作用机制研究，以此为米老排在低磷环境下提高磷元素吸收利用效率和抗逆性以及促进生长提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验在福建农林大学森林生态系统过程与经营重点实验室进行，米老排幼苗栽植于福建农林大学田间实验地。试验所用的米老排幼苗为福建省上杭白砂国有林场所提供的生长良好、无病虫害的一年实生幼苗。

供试菌株：前期从生长健壮、无病虫害的一年生米老排幼苗根、茎、叶样品中分离纯化内生真菌，选择10 种内生真菌，分别为叶片中分离出的M1、M2，根系中分离出的M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9 以及茎中分离出的M10，经鉴定后菌株信息如下：青霉属（Penicilliumsp.，M1）、枝孢属（Cladosporiumsp.，M2）、双毛座孢属（Thozetella pinicolasp.，M3）、Gliocladiopsissp.（M4）、枝孢属（Cladosporiumsp.，M5）、拟盘多毛孢属（Pestalotiopsissp.，M6）、间座壳属（Diaporthesp.，M7）、Tainosphaeriasp.（M8）、青霉属（Penicilliumsp.，M9）、Gliocladiopsissp.（M10）。

1.2 试验方法

试验以土培盆栽的方式进行，选择长势相似的苗木，于2021 年4 月15 日将其定植于23 cm×21.5 cm×18 cm（上圆直径×下圆直径×高）的塑料盆中，每盆放入经高压灭菌后的黄壤，约6.5 kg。待植株经过2 个月恢复性生长后，于6 月15 日开始进行接种试验。从植物体顶部施浇100 mL 相同浓度的10 种菌株菌液，确保根、茎、叶以及土壤均有菌液，3 次重复，同时施浇相同体积的无菌水作为对照（CK）。接种15 d 后进行磷胁迫处理，胁迫60 d 后进行指标测定。

1.2.1 菌液配置 恒温28℃下，通过马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）将10 株纯化并且存活的内生真菌培养一周，然后将培育良好的内生真菌转接到50 mL 马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）中，进行72 h 的恒温摇床震荡（28℃、180 r/min），利用血球计数板计算菌液浓度，经无菌水稀释后，配制成5.5×106CFU/mL 菌液。

1.2.2 低磷胁迫试验设计 米老排幼苗土壤盆栽试验设计，采用KH2PO4设置胁迫梯度，共设置4 个磷胁迫梯度：18 mg/kg（正常条件）、12 mg/kg（轻度胁迫）、6 mg/kg（中度胁迫）、0 mg/kg（重度胁迫）［14］，3 次重复，分别对应11 种接菌方式，共计132 盆。

1.3 指标测定

地上部生长量：分别用皮尺和游标卡尺测量苗高（cm）和地径（mm），计算试验前后的增量。

生物量：烘干后测量地上部和根系生物量，计算根冠比。

叶片酸性磷酸酶活性（APA）测定：称取洗净的叶片0.05 g 放入含5 mL（pH 5.0、0.2 mol/L）醋酸－醋酸钠缓冲液和5 mL 对硝基苯磷酸二钠（5 mmol/L）的试管中，使用恒温培养箱30℃暗保持30 min。随之加入NaOH 终止反应，在波长为405 nm 下进行比色［15］。

根系APA 测定：称取洗净的较细米老排根部0.1 g，加0.2 mol/L 的醋酸钠醋酸—醋酸钠缓冲液，进行冰浴匀浆。匀浆放置离心管中并放入冰箱，1 h 后10 000 r/min 离心30 min。取出上清液进行根系APA 测定［16］。土壤酸性磷酸酶活性测定参考张海伟［17］等方法，植物磷含量测定采用钼锑抗比色法［18］。

数据的整理使用Excel 2016 完成，采用SPSS 19.0 进行方差分析及差异性检验，并利用Origin 19.0 进行作图。

2 结果与分析

2.1 磷胁迫下内生真菌对米老排幼苗地上部生长量的影响

不同磷胁迫下，接种内生真菌的米老排幼苗苗高（表1）和地径（表2）增量均呈现先增后降的变化趋势。不同磷胁迫下接种菌株M1 的米老排幼苗苗高与地径增量显著。随着胁迫程度的增加，接种菌株M9 的米老排幼苗苗高与地径的增量较高，在中度胁迫时苗高增量显著高于CK，在重度胁迫时地径增量较为显著。接种菌株M8 在不同程度胁迫时均能显著提高米老排幼苗地径。在重度胁迫时，接种菌株处理的米老排幼苗地径增量均高于CK。

表1 磷胁迫下内生真菌对米老排幼苗苗高（cm）的影响Table 1 Effects of endophytic fungi on height (cm) of Mytilaria laosensis seedlings under phosphorus stress

表2 磷胁迫下内生真菌对米老排幼苗地径（mm）的影响Table 2 Effects of endophytic fungi on ground diameter (mm)of Mytilaria laosensis seedlings under phosphorus stress

2.2 磷胁迫下内生真菌对米老排幼苗根冠比的影响

不同磷胁迫下内生真菌对米老排幼苗根冠比的影响如表3 所示，不同胁迫下米老排幼苗根冠比均小于1，地上部的干重显著大于根系。随着胁迫程度的增加，接种菌株M3、M4、M9 的米老排幼苗根冠比呈增加趋势，接种菌株M5、M7、M8 的根冠比呈先增加后减小的变化趋势，接种菌株M6 的根冠比呈减小趋势。在轻度胁迫和中度胁迫下，接种菌株M10 的米老排幼苗根冠比较CK 显著增加。

表3 磷胁迫下内生真菌对米老排幼苗根冠比的影响Table 3 Effects of endophytic fungi on root/shoot ratio of Mytilaria laosensis seedlings under phosphorus stress

2.3 磷胁迫下内生真菌对米老排幼苗磷含量的影响

2.3.1 地上部磷含量 如图1 所示，随着磷胁迫程度增加，接种内生真菌能够有效促进米老排幼苗的生长。在正常条件下，接种菌株M6、M10的米老排幼苗地上部磷含量分别较CK 显著增加36.9%、33.25%；在轻度胁迫下，接种菌株M1、M10 的米老排幼苗地上部磷含量较CK 显著增加4.48%、23.0%；在中度胁迫下，接种菌株M9、M10 的米老排幼苗地上部磷含量较CK 显著增加29.9%、27.2%。重度胁迫处理下，接种菌株M4、M6、M9 对米老排幼苗地上部磷含量均有不同程度的促进作用，其中接种M6 的磷含量较CK显著增加41.1%。因此，在正常条件和重度胁迫下菌株M6 能够有效提高米老排幼苗地上部磷含量，随着胁迫程度增加，菌株M9 的促进效果更为突出，除重度胁迫外，菌株M10 均具有显著促进作用。

图1 磷胁迫下内生真菌对米老排幼苗地上部磷含量的影响Fig.1 Effects of endophytic fungi on aboveground phosphorus content of Mytilaria laosensis seedlings under phosphorus stress

2.3.2 根系磷含量 根是植物重要的水分和养分吸收器官，在不同磷水平下的形态变化可以反映其对磷的需求和适应能力［19］。随着磷胁迫程度的增加，接种菌株后的米老排幼苗地下部磷含量呈现下降趋势（图2）。在正常条件下，接种菌株M6、M7、M9 的米老排幼苗地下部磷含量较CK 显著增加，分别增加58.3%、74.35、80.6%。在轻度胁迫下，仅接种菌株M1、M2 的米老排幼苗地下部磷含量增加。在中度胁迫下，接种菌株M4、M10 的米老排幼苗地下部磷含量较CK 显著增加，分别增加49.2%、48.5%。重度胁迫下，除菌株M8 外，接种其余菌株的米老排地下部磷含量较CK 均有增加，其中接种菌株M4 较CK 具有显著性差异，增加57.7%。因此，随着胁迫程度增加，菌株M4 能够显著增加米老排幼苗地下部磷含量。

图2 磷胁迫下内生真菌对米老排幼苗根系磷含量的影响Fig.2 Effects of endophytic fungi on root phosphorus content of Mytilaria laosensis seedlings under phosphorus stress

2.4 磷胁迫下菌种对米老排幼苗及土壤APA 的影响

2.4.1 叶片APA 随着胁迫程度的增加，接种不同菌株后的米老排幼苗叶片APA 活性呈现不同的变化趋势（图3）。在正常条件和轻度胁迫下，接种菌株M10 的米老排幼苗叶片APA 较CK 均有提升，且差异显著，分别增加32.4%、22.4%。在中度胁迫下，接种菌株M9 的米老排幼苗叶片APA 较CK 显著增加28.9%。在重度胁迫下，接种菌株M6、M9 的米老排幼苗叶片APA 较CK 显著增加40.3%、11.39%。由此可见，随着胁迫程度的增加，菌株M9 与菌株M6 的促进作用逐渐凸显。

图3 磷胁迫下内生真菌对米老排幼苗叶片酸磷性酶活性（APA）的影响Fig.3 Effects of endophytic fungi on leaf acid phospatase activity (APA) of Mytilaria laosensis seedlings under phosphorus stress

2.4.2 根系APA 由图4 可知，随着磷胁迫程度的增加，接种不同菌株后的米老排幼苗根系APA均有一定程度的提升。在正常条件、中度胁迫和重度胁迫下，菌株处理后的米老排幼苗根系APA较CK 均有显著提升。在正常条件下，接种菌株M9 米老排幼苗根系APA 较CK 显著增加77.6%。在轻度胁迫下，接种菌株M2、M7 米老排幼苗根系APA 较CK 显著增加7.9%、17.8%。其中菌株M7 对于提高根系APA 具有显著的促进作用，在各处理条件下的根系APA 均高于对照，以正常条件下促进作用最显著。

图4 磷胁迫下内生真菌对米老排幼苗根系酸磷性酶活性（APA）的影响Fig.4 Effects of endophytic fungi on root acid phospatase activity (APA) of Mytilaria laosensis seedlings under phosphorus stress

2.4.3 土壤APA 磷胁迫下内生真菌对米老排幼苗土壤APA 的影响如图5 所示。随着胁迫程度的增加，接种不同菌株后的土壤APA 变化趋势不同，其中接种菌株M5 能够显著提升在正常条件、轻度胁迫和重度胁迫下的土壤APA，分别为59.2%、89.5%、65.8%。正常条件下，接种菌株M9、M10的土壤APA 较CK显著提升65.1%、38.75%。在轻度胁迫下，除接种菌株M5 外，接种其他菌株差异不显著。中度胁迫下，仅接种菌株M6 的土壤APA 较CK 显著提升18.4%。

图5 磷胁迫下内生真菌对米老排幼苗土壤酸磷性酶活性（APA）的影响Fig.5 Effects of endophytic fungi on soil acid phospatase activity (APA) of Mytilaria laosensis seedlings under phosphorus stress

3 讨论

胁迫环境会造成植物生长缓慢、产量降低等特点。研究表明，接种内生真菌能够显著促进低磷胁迫下杉木幼苗的生长［20］。本研究也发现，接种菌株M9 的米老排幼苗苗高与地径的增量较高且根冠比呈增加趋势，接种菌株M10 的米老排幼苗根冠比显著增加，这可能因为内生真菌侵染可提高植物对营养元素的吸收和累积，也可能是因为内生真菌分泌植物生长所需的植物激素，从而促进米老排幼苗苗高地径的增加和根系生长［21］。随着胁迫程度的增加，接种菌株M5、M7 和M8 的根冠比先增加后减小，可见，随着胁迫增加，这些菌株相较于菌株M9、M10 的促生能力逐渐减弱。

在低磷环境下，内生真菌可以促进幼苗产生有利于植株生长的激素，同时植物体内也会形成适应性机制，以提高植株对磷素的吸收效率［22］。本研究中，接种内生真菌的米老排幼苗地上部及地下部的磷含量均不同程度的增加，其原因可能是在胁迫环境作用下，幼苗根系所吸收的磷可能被运输到地上部分，以此满足地上器官对于磷素的需要，共同抵抗胁迫环境［23-24］。在正常条件和重度胁迫下菌株M6 能够有效提高米老排幼苗地上部磷含量。随着胁迫程度的增加，菌株M9显著提高米老排幼苗地上部磷含量，菌株M4 显著提高地下部磷含量。这可能是因为内生真菌在植株适应胁迫环境的过程中发挥了较大作用，内生真菌可以有效促进植株对营养元素的吸收。除重度胁迫外，菌株M10 均能有效促进米老排幼苗地上部磷含量，随着胁迫程度的增加，接种菌株后的米老排幼苗地下部位磷含量呈现下降趋势，这可能是由于胁迫程度的加深，外部环境所能提供可供植株生长的磷元素越来越少，不利于幼苗的正常生长发育。有研究表明，根系是胁迫环境带来伤害的首要部位，因此菌株对植物的促生效果在根系部位更加显著，对植物生理的响应机制也更加迅速［25-26］。本研究发现，在相同磷胁迫处理下，米老排幼苗地下部磷含量均比地上部低，该结果与赵杨景等［27］研究结果一致，随着胁迫程度增加，地下部的磷含量下降趋势较为缓慢，造成这种现象的原因可能是在根系部分，植物自身的生理响应机制会更加迅速，同时在与内生真菌的协作下，对植株适应胁迫环境有着更加显著的促进作用［28］。

低磷胁迫会诱导植物根系酸性磷酸酶、核酸酶及有机酸的合成和分泌，增加土壤中无机磷的含量［29］。本研究结果表明，随着胁迫程度的增加，菌株M9 与菌株M6 的促进叶片APA 的作用逐渐凸显，其中在重度胁迫下显著增加40.3%、11.39%。在正常条件、中度胁迫和重度胁迫下，菌株处理后的米老排幼苗根系APA 较CK 均有显著提升。这可能是因为在胁迫环境下，植物自身也会快速响应，形成适应性机制来提高自身的抗逆性。APA 的增加有助于提高米老排幼苗对细胞中贮存磷的活化利用率，提升米老排在胁迫环境的抗逆性［30］。叶片APA 在不同的磷胁迫梯度下，大部分菌株呈现先上升的变化趋势，这与艾如波等［31］试验结果一致，大部分菌株在轻度胁迫处理下APA 高于正常条件。随着胁迫程度的增加，叶片与根系的APA 出现降低的变化趋势，这与梁霞［32］的研究结果不同，其原因可能是：在短期胁迫时间与轻度胁迫环境下，接种的菌株可能会提高植株体内的APA，但随着胁迫程度增加与胁迫时间延长，米老排幼苗自身调节能力有限，菌株对于APA 的促进作用逐渐减弱。本研究还发现，接种菌株M5、M9、M10 在不同胁迫条件下，均能相对提高土壤APA，说明这些菌株可以刺激根系分泌更多的酸性磷酸酶，促进土壤有机磷转化为无机磷［33］。研究证实，磷胁迫环境下植株所表现出的酶活性变化规律可能不同：有些植株体内和根系会分泌更多的磷酸酶以此提高对外部环境中磷素的吸收与利用效率，但有些植物［34-35］。因此，植物自身的生长特性以及遗传因素也可能是导致本试验结果的原因之一。幼苗叶片与根系的APA 变化规律存在个体差异，可能与米老排自身的营养遗传特性有关［35］。今后可基于本研究成果，尝试用更加完善和精准的标准进行内生真菌的选择，研究米老排自身的营养遗传特性，为米老排的生长发育提供更加适宜的种植环境，调节米老排栽种地区的土壤酸碱度，为解决米老排缺磷问题提供有效方法。

4 结论

本研究发现，接种菌株M9、M10 能够促进米老排幼苗生长，菌株M4、M6、M9 能够显著增加米老排幼苗磷含量，接种菌株M6、M9 均能显著提高米老排幼苗叶片、根系以及根际土壤酸性磷酸酶活性。