不同成熟期草莓果实风味指纹图谱构建及差异分析

蔡冰冰，李 宁，李 成，薛占军，李青云

（1.河北农业大学 园艺学院，河北 保定 071000；2.河北农业大学 华北作物改良与调控国家重点实验室，河北 保定 071000；3.河北省蔬菜产业协同创新中心，河北 保定 071000）

草莓（Fragaria ananassaDuch.）属蔷薇科草莓属的多年生草本植物［1］，因其酸甜可口、营养价值高而深受大众的喜爱，享有“水果皇后”的美誉［2］。果实香气是人们通过嗅觉可以感觉到的挥发性气味物质，它与水果的品质、加工特性及营养价值密切相关［3］，既是衡量草莓品质的重要指标，又是吸引消费者和增强市场竞争力的重要因素［3-4］。由于消费需求和栽培模式的差异，不同国家选育和主栽的草莓品种在品质特性方面存在差异。欧美品种产量高、抗性强，但是香味淡；而日本品种香味浓、甜度高，但抗性较差、不耐储运［5］。根据我国消费者的消费需求，我国草莓生产多引自日本，近年来随着我国草莓研究的不断深入，也陆续培育出众多产量高、果形好、香味浓郁的国产品种，并备受消费者好评［6］。河北省保定市是全国重要的草莓种植基地，因此分析草莓果实的香气成分，可以为改良草莓香气品质、培育新品种以及种质资源的保存和利用提供理论依据［8］。目前，在草莓果实中检测并鉴定的挥发性物质达360 余种，主要为酯类、醇类、醛类、酮类、萜烯类、呋喃类及含硫化合物等［9-12］，其中酯类物质含量最多。基因型是影响果实挥发性香气成分的主要因素，另外，果实成熟度、气候条件、栽培方式、采后处理等也会影响水果香气成分的组成和含量［13-19］。

气象色谱-离子迁移谱（Gas Chromatography-Ion mobility spectrometry，GC-IMS）是20 世纪60年代末70 年代初发展起来的一种气体分离和快检技术，该技术基于气相中不同离子在电场中迁移速度的差异，从而对化学离子物质进行表征［20］。该技术结合了气相色谱的分离能力和迁移离子谱快速响应的优势［21］，克服了离子迁移谱技术分离度差的局限性［22］，具有分辨率高、灵敏度高、选择性强、分析高效、操作简便等特点，已经应用于食品风味分析、品质检测等多个领域［23-29］。

但是，目前缺少基于GC-IMS 技术分析不同品种草莓不同成熟期挥发性有机物质的研究。因此，本试验以满城区沃土现代农业产业园区的3 个不同草莓品种为试材，采用GC-IMS 技术，结合正交偏最小二乘法判别分析（Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）、模型验证及重要变 量 投 影（Variable importance in the projection，VIP）值分析等化学计量学方法，构建指纹图谱及成分含量变化热图，讨论不同草莓品种挥发性香气成分差异及不同成熟期果实挥发性化合物含量的变化，为草莓优质生产、品质鉴定、贮藏保鲜和风味育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

草莓‘香野’‘圣诞红’‘红颜’草莓于 2022年 1 月 12 日采自保定市满城区沃土现代农业产业园区，草莓在砖墙日光温室内采用高架椰糠基质栽培，追施‘圣诞树’牌水溶肥和氨基酸肥，并于当日送达实验室。选用大小均匀、无病虫害、无机械损伤的草莓白果期、粉色转色期（50% 粉色）、红色成熟期果实，对挥发性有机物含量进行检测。

2- 甲 基-3 庚 酮 购 自 德 国 Dr.Ehrenstorfer 公司。Flavour spec®气相离子迁移谱联用仪 购自德国G.A.S 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 GC-IMS 分析条件 参考王福成等［30］的方法。

（1）自动进样条件：准确称取2.5 g 草莓样品置于20 mL 顶空瓶中；将顶空瓶中的样品进行孵化，孵化温度为40 ℃；振荡器转速为500 r/min；孵化时间为10 min；使用加热的进样针抽取瓶内的顶空组分，进样针温度为85 ℃；进样体积为1.0 mL；以2-甲基-3 庚酮（色谱纯）作为内标物质，通过GC-IMS 分析挥发性有机物。

（2）GC 条件：色谱柱温度为 60 ℃；运行时间40 min；载气为氮气（≥99.999%）；载气流量：0 ～2 min：2 mL/min；2 ～10 min：2 ～15 mL/min；10 ～25 min：15 ～100 mL/min；25 ～30 min：100 mL/min。

1.3 数据分析

采用GC-IMS 仪器配套的VOCal 软件（内置的NIST 数据库和IMS 数据库）对样品中的挥发性风味化合物进行定性分析，利用Reporter 和Gallery Plot 插件对比指纹图谱的差异；借助Dynamic PCA插件对样品进行聚类分析，以确定未知样品的种类；采用SIMCA 14.1 进行PLS-DA 分析；应用TBtools软件绘制相关热图。

2 结果与分析

2.1 草莓样品中挥发性有机物定性分析

为了分析不同品种草莓在不同成熟期挥发性化合物的含量变化，使用 GC-IMS 中 Library Search内置的 NIST 2014 数据库和 IMS 数据库对检测出的挥发性有机物进行定性分析。共检测出有机物 54 种，可以定性的有机物 53 种。其中，酯类 16 种，醇类11 种，醛类 9 种，酮类 8 种，醚类 3 种，吡嗪类 2 种，酸类、烯烃类、硫类各 1 种。各化合物的定性信息如表 1 所示。

表1 挥发性有机物定性信息Table 1 Qualitative information of volatile organic compounds

续表：

2.2 不同品种草莓果实中的香气物质种类及含量

从整体来看，酯类物质在 3 个品种草莓果实中的含量最高，其在 3 个品种中的含量按照从大到小的顺序排列为：‘圣诞红’＞‘红颜’＞‘香野’，分别为172.02、170.10 和 169.37 μg/g，可能是草莓果实呈现香气的主要挥发性物质，醇类、醛类、酮类、醚类物质含量相对较高，吡嗪类、酸类、烯烃类、硫类含量较小。

表2 不同品种草莓香气物质种类及含量比较Table 2 Comparison of aroma substance and content of different strawberry varieties

2.3 不同品种草莓果实中的香气成分分析

在 3 个品种的草莓果实中共鉴定出定性的挥发性香气物质 53 种。在酯类物质中，己酸甲酯、丁酸乙酯在 3 个品种草莓果实中含量最高，品种间无显著性差异，丁酸甲酯在 3 个品种草莓果实中含量较高，且‘香野’和‘圣诞红’中得含量显著高于‘红颜’；醇类物质中，乙醇在 3 给品种草莓果实中得含量均大于5.0 μg/g，且品种间无显著性差异，另外，甲基苯甲醇、5-甲基-2-呋喃甲醇在‘香野’和‘圣诞红’中的含量较高，且显著高于‘红颜’；在醛类物质中，3 个品种中丁醛的含量最高，且品种间无显著性差异；在酮类物质中，3-戊酮在‘香野’和‘圣诞红’中含量最高，且显著高于‘红颜’；醚类物质中，甲基叔丁基醚在‘香野’中含量最高，与‘红颜’无显著性差异，显著高于‘圣诞红’。另外，3个草莓品种果实中均检测到未定性的化合物。

2.4 不同品种草莓在不同成熟期挥发性有机物指纹图谱差异

挥发性有机物的指纹图谱可以更直观的展示挥发性有机物组分的差异。结果表明，随着果实成熟度增加，其挥发性风味物质发生了明显的变化。结合聚类热图及数据分析发现，大部分有机物含量均随着果实成熟度的增加，而显著增加。

表3 不同品种草莓中挥发性有机物含量Table 3 Content of volatile organic compounds in different varieties strawberries

图1 3 种草莓品种果实不同成熟期挥发性有机物指纹图谱Fig. 1 Finger print of volatile organic compounds in different varieties strawberries

2.5 不同品种草莓在不同成熟期时的挥发性有机物的主成分分析

PCA 是多元统计分析中常见的数据分析方法，PCA 可以根据不同样本中的主要成分因子的贡献率来评估样品之间的规律性和差异性。将试验测定的54 种挥发性有机物进行 PCA 分析，结果表明，第一主成分的贡献率为 48.44%，第二主成分贡献率为23.54%，这2 个主成分累计贡献率为 71.99%。组内各样品相对距离较近，说明样品的重复性较好。不同成熟期，3 个草莓品种基本分布在不同区域，表明样品之间的挥发性有机物存在差异。其中，在白果期和粉果期，挥发性有机物含量差异较小；在红果期，草莓果实中挥发性有机物含量变化最为明显。说明红果成熟期，草莓果实的风味变化最大。

图2 不同成熟期草莓果实中挥发性有机物的 PCA 得分图Fig. 2 PCA scores of volatile organic compounds in strawberry fruits in different maturity stages

2.6 不同品种草莓不同成熟期果实中挥发性有机物的偏最小二乘法判别分析

PLS-DA 通过降维将复杂数据直观化，PLS-DA具有监督分析的功能，属于模型方法，可以预设分类，弥补 PCA 方法的不足，强化组间的差异。相同处理样品分布点距离越近，说明这些样品中所含有的化合物的组成和含量越接近。为进一步分析草莓果实不同成熟期的差异性挥发性有机物，基于已测定的54 种挥发性有机物，采用 PLS-DA 方法分析不同成熟期对挥发性有机物含量的影响。结果如图 3 所示，数据的分类算法效果较好，可以将不同成熟期样本点分开，其中红果期区分最明显。说明不同成熟期的草莓果实内在有机物成分存在一定差异，其中红果期差异最明显。

图3 不同成熟期草莓果实中挥发性有机物 PLS-DA 得分图Fig. 3 PLS-DA scores of volatile organic compounds in strawberry fruits in different stages

2.7 不同品种草莓果实不同成熟期的特征挥发性有机物分析

变量投影重要性（Variable Important for the Projection, VIP）可以量化PLS-DA 的每个变量对分类的贡献，通常认为 VIP 大于 1 表示在判别过程中有重要贡献。如图 4 所示，共得到 29 种 VIP 值大于 1 的挥发性有机物。除去未定性的化合物，并结合方差分析，虽然己酸甲酯和丁酸乙酯在3 个品种草莓果实种含量均较高，但是品种间无显著性差异（P＞0.05），因此得出 26 种可以用来判别不同品种草莓果实的特征风味物质，分别为丁酸丁酯、己酸甲酯、异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、戊酸乙酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯、异戊酸甲酯、乳酸乙酯、丙烯酸乙酯、醋酸异丙酯、芳樟醇、3-甲硫基丙醇、正己醇、2-己烯醇、3-甲基-1-戊醇、反式-2-己烯-1-醇、2-甲基-1-丁醇、反式-2-己烯醛、异丁醛、己醛、2-庚酮、4-甲基-2-戊酮、3-羟基-2-丁酮、3-戊酮、二乙二醇二甲醚、2-蒎烯和二烯丙基二硫。结合不同品种果实不同成熟期挥发性有机物含量变化热图，丁酸丁酯、己酸甲酯、异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、异戊酸甲酯、丙烯酸乙酯、芳樟醇、3-甲硫基丙醇、正己醇、3-甲基-1-戊醇、2-庚酮、4-甲基-2-戊酮、二乙二醇二甲醚、二烯丙基二硫在3 个品种草莓果实的红果期，含量均显著增加。

图4 挥发性有机物 VIP 得分图Fig. 4 VIP score of volatile organic compounds

3 讨论

草莓是香味物质种类最丰富的水果之一，成熟草莓果实中含有多种挥发性的香气成分，果实的香气也是由若干种芳香类物质共同发挥作用，并且当含量超过感知阈值时形成的［31-32］。本试验通过对 3种不同草莓品种成熟期果实中挥发性有机物检测及主成分分析，发现酯类在所有品系中种类最多，己酸甲酯和丁酸乙酯在 3 个品种中的相对浓度最高；醇类、醛类、酮类和醚类化合物在果实香味形成中也有重要作用。高含量的酯类物质可以呈现出令人愉悦的果香味［33］。

赵娜［34］对‘章姬’‘甜查理’‘隋珠’‘圣诞红’‘红颜’和‘艳丽’ 6 个品种草莓进行香气成分测定，发现香气物质种类及相对含量以酯类化合物最多；王娟等［35］测定了‘京桃香’‘白雪公主-15’‘白雪公主-6’‘香山公主’‘玫瑰公主’‘玉泉公主’‘红颜’‘甜查理’ 8 个草莓品种的挥发性化合物种类及相对含量，得到了与之一致的结论。张运涛等［36］对‘红颜’‘章姬’‘枥乙女’‘甜查理’‘卡姆罗莎’5 个草莓品种进行香气成分测定，结果显示酯类物质含量最多，与本试验的结果一致。由此可以判断，酯类物质是草莓果实的主要香气物质，且其含量占总含量的 50% 以上。

赵娜［34］研究测定了‘圣诞红’‘红颜’中的香气物质，发现‘圣诞红’的主要特征香气物质是3-己烯-1-醇乙酸酯，‘红颜’中的主要特征香气物质是2-己烯-1-醇乙酸酯、丁酸、2-己烯酯和丁酸己酯，2 个品种中的香气物质相似性较大；王娟等［35］分析了‘红颜’草莓的风味和香气物质，发现‘红颜’具有花香味，在‘红颜’中未检测到2-甲基丁酸乙酯、2-庚醇。本试验在 3 个品种中均检测到了相对含量较高的乙酸乙酯。张运涛［36］测定‘红颜’草莓的挥发性香气物质，也发现乙酸乙酯的相对含量最高。但是一般认为乙酸乙酯具有较高的味阈值［37］，所以该物质对草莓香味的作用仍不明确。另外，己酸乙酯和己酸甲酯、丁酸乙酯和丁酸甲酯在红颜品种的香味中同样起重要作用［36］。本试验同样在 3个草莓品种中均检测到较高的己酸甲酯、丁酸乙酯和丁酸甲酯，而且这3 种物质在 3 种品种草莓的成熟期含量均显著增加，表明这3 种物质可能是草莓主要的香气物质。(E)- 2-己烯醛的青绿叶味对‘红颜’品种形成特有的茉莉和玫瑰清爽香味也有作用［35-36］，本试验在 3 个品种草莓中均检测到反式-2-己烯醛，但该物质的含量在 3 个品种中差异较大，并且在 3 个品种草莓果实的成熟期含量均显著降低，这可能是引起 3 个品种风味差异的原因之一。另外，丁醛的含量在‘乡野’和‘圣诞红’成熟期显著增加。酸类物质在一定范围内具有果香味［38］，而 3 个品种中的酸类物质含量均较低，所以 3 个品种的甜度较高，这可能会使其他风味体现的更浓郁。甲基叔丁基醚的含量在 3 个品种草莓的成熟期显著增加，这可能是影响草莓香气的重要有机物。

4 结论

通过对 3 个品种草莓果实的分析检测，酯类物质种类最多，含量最高，在 3 个品种草莓香气形成中发挥重要作用。草莓香味不仅取决与酯类物质，还与醛类、酸类、醚类等有关。丁酸丁酯、己酸甲酯、异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、异戊酸甲酯、丙烯酸乙酯、芳樟醇、3-甲硫基丙醇、正己醇、3-甲基-1-戊醇、2-庚酮、4-甲基-2-戊酮、二乙二醇二甲醚、二烯丙基二硫是影响草莓香气的重要有机物。