柱前衍生法测定岩藻多糖中的岩藻糖含量

周宏霞，王 楠，都 颖，王 妙，张 羽

（威海市食品药品检验检测研究院，山东 威海 264200）

岩藻多糖也称褐藻多糖硫酸酯，是以岩藻糖和硫酸基为主要特征的一类水溶性多糖。Kylin在1913年首次从掌状海带中提取，并命名为Fucoidin，现在已统一定名为岩藻多糖（Fucoidan）或岩藻聚糖硫酸酯（Sulfated Fucan）[1]。以海带、裙带菜等褐藻为原料，经精制提取可以得到多糖类产品——岩藻多糖[2]。岩藻多糖具有多种生物活性，包括抗肿瘤、抗凝血、抗病毒、降血糖、降血脂、免疫调节等活性，是一种重要的生物活性物质[3-5]。L-岩藻糖是影响岩藻聚糖生物活性的重要组成成分，岩藻聚糖硫酸酯的重要指标性成分。而且L-岩藻糖作为岩藻聚糖的特征单糖，常用于衡量岩藻聚糖的纯度[6]。因此，在测定褐藻制品中岩藻糖含量时，以测定L-岩藻糖的含量来表示。目前，检测岩藻糖的方法有气相色谱法[7-9]、高效液相色谱-柱前衍生化紫外检测法[10]或蒸发光法[11]、离子色谱法[6]等。其中，高效液色谱-柱前衍生化紫外检测法用的比较广泛。在SC/T 3404—2012中有关于岩藻糖测定的方法，但是应用该方法进行衍生，生成的衍生物质不大稳定，造成结果重现性不好。在该方法的基础上进行了改进与研究，建立了一种比较稳定的柱前衍生-高效液相色谱法测定L-岩藻糖的方法。

1 仪器与试剂

1.1 试验试剂

乙腈、甲醇（色谱纯，Thermo）；磷酸二氢钾（优级纯）；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）（≥99.0%，麦克林）；三氟乙酸（优级纯）；氢氧化钠（优级纯）；三氯甲烷（色谱纯）；冰乙酸（色谱纯）；盐酸（优级纯）；氨水（分析纯）；L-岩藻糖（L/Stanford Chemicals，≥99.5%）；试验用水为去离子水。

1.2 试剂配制

4 mol/L三氟乙酸溶液：准确量取三氟乙酸溶液29.7 mL，加水定容至100 mL。4 mol/L氢氧化钠溶液：准确称取氢氧化钠16.0 g，加水溶解并定容至100 mL。0.1 mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液：准确称取磷酸二氢钾1.36 g，加水80 mL溶解，用氨水调节pH值为6.0，再用水定容至100 mL。0.5 mol/LPMP甲醇溶液：准确称取PMP 8.71 g，用甲醇溶解并定容至100 mL。0.3 mol/L氢氧化钠溶液：准确称取1.2 g氢氧化钠，加水溶解并定容至100 mL。0.3 mol/L盐酸溶液：准确移取盐酸溶液2.5 mL，用水稀释至100 mL。0.05 mol/L磷酸二氢钾缓冲液：准确称取磷酸二氢钾6.8 g，加80 mL水溶解，用氢氧化钠溶液调节pH值为6.0，再用水定容至1 000 mL，备用。L-岩藻糖溶液配制：精密称取L-岩藻糖10 mg，用水溶解定容至10 mL，配制成浓度为1.0 mg/mL的储备液。

1.3 仪器

高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器；分析天平；涡旋混合器；电热恒温干燥箱；恒温水浴锅；超声波清洗器，Mili-Q超纯水机。

2 试验方法

2.1 色谱条件

色谱柱（C18柱，Venusil MP 4.6 mm×250 mm，5 μm，艾杰尔科技有限公司），柱温为40℃，流速为1.0 mL/min，流动相为0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值6.8）-乙腈（体积比为85∶15），检测器：二极管阵列检测器，波长254 nm，进样量为20 μL。

2.2 岩藻多糖的水解

准确称取岩藻多糖样品0.1 g（精确至0.000 1 g）于水解管中，加入4 mol/L三氟乙酸溶液10 mL，混匀后充入氮气封盖，在110℃电热恒温干燥箱中水解2 h，取出后冷却至室温，加入4 mol/L氢氧化钠溶液10 mL中和，调节pH值至中性。将水解液转移到25 mL容量瓶中，用0.1 mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液定容至刻度，备用。根据样品中岩藻糖含量的不同可以进行不同浓度的稀释。

2.3 试样的衍生及净化

准确移取定容后的水解液450 μL于10 mL塑料离心管中，加入0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）甲醇溶液450 μL和0.3 mol/L氢氧化钠溶液450 μL，涡旋混合，70℃水浴反应70 min，取出冷却至室温，加0.3 mol/L盐酸溶液450 μL，涡旋混合，加三氯甲烷溶液2 mL，充分振荡，静置分层，吸弃下层三氯甲烷层，重复萃取2次。上清液过0.45 μm的滤膜，供高效液相色谱仪分析。

2.4 标准溶液的衍生化

准确移取适量的标准储备溶液，用水稀释成1，5，10，50，100，200，500 μg/mL的标准工作液，分别取450 μL于10 mL塑料离心管中，按照2.3的操作进行衍生化，上机检测，绘制校准曲线。

3 结果与分析

3.1 衍生条件的优化

采用相同的衍生液、衍生温度和衍生时间进行试验发现，用盐酸溶液中和的稳定性要优于醋酸溶液中和。王泽文等人[10]对岩藻糖的衍生温度和衍生时间进行研究发现，采用70℃反应70 min能充分反应完全。因此采用了70℃水浴反应70 min。衍生反应后，由于PMP试剂在波长245 nm处有很大的紫外吸收，为防止试验中PMP残留对衍生物检测的干扰，在试验中用三氯甲烷去除剩余的PMP。

3.2 色谱条件的优化

采用磷酸盐缓冲液（pH值6.8）-乙腈（体积比为85∶15）为流动相，在该条件下目标物质和杂质能很好地分离。检测器采用二极管阵列检测器，采集光谱图，通过顶点的光谱图的不同，可以很好地区分岩藻糖和杂质。

岩藻糖衍生物谱图见图1，岩藻糖衍生物光谱图见图2。

图1 岩藻糖衍生物谱图

图2 岩藻糖衍生物光谱图

3.3 线性关系考查

按照2.1色谱条件，分别测定L-岩藻糖系列标准工作溶液，每个浓度测定1次，记录L-岩藻糖色谱峰面积，以L-岩藻糖系列标准工作溶液的质量浓度X（μg/mL）为自变量、色谱峰面积Y为因变量，进行线性回归，得线性方程：Y=0.673 9X+2.281 6，相关系数R2为0.999，表明L-岩藻糖的质量浓度在1～500 μg/mL范围与色谱峰面积线性关系。

岩藻糖校准曲线见图3。

图3 岩藻糖校准曲线

3.4 精密度试验（n=6）

取100 μg/mL L-岩藻糖，按照2.3方法进行衍生，精密吸取20 μL该溶液，进样后测得色谱峰面积，连续重复进样6次，计算其相对标准偏差。结果为：RSD为0.73%，说明仪器有良好的精密度。

3.5 稳定性试验结果（n=6）

称取100 μg/mL L-岩藻糖，按照2.3方法进行衍生，精密吸取20 μL该溶液，在0，4，8，10，12，24 h依次进样一次，测定峰面积值，连续进样6次，计算其相对标准偏差，结果为：RSD为0.58%。说明该对照品溶液的衍生化在24 h有良好的稳定性。

3.6 重复性试验结果（n=6）

准确称取岩藻多糖样品0.1 g 6份样品，按照本文的方法进行水解和衍生，计算相对标准偏差。结果为：2.68%，说明该方法具有良好的重复性。

3.7 加标回收率试验

准确称取岩藻糖浓度为15.6%的岩藻多糖样品0.1 g 6份，加入岩藻多糖标准溶液，使样品中的加标浓度为15%，按照试验方法进行水解和衍生，计算加标回收率和相对标准偏差，分别为94.7%和5.27%。

岩藻糖回收率试验见表1。

表1 岩藻糖回收率试验/%

4 结论

采用PMP柱前衍生法和高效液相色谱法对岩藻多糖中的L-岩藻糖质量浓度进行了测定分析，结果表明，该方法测定L-岩藻糖质量浓度简便、快捷，结果的稳定性，重复性好，测定结果准确。PMP衍生单糖后使其带上发色基团，从而有紫外吸收，采用二极管阵列检测器能得到样品中物质的光谱图，可以很好地区分岩藻糖衍生物和杂质。通过该方法的测定，可以得到岩藻多糖中L-岩藻糖的含量，从而判定该产品是否符合岩藻多糖的产品标准，达到对岩藻多糖产品质量的控制。