超声波联合乳酸对金黄色葡萄球菌的杀菌效果

张娇娇， 吴海虹， 孙晋跃， 孙远成， 孙芝兰， 刘 芳,， 徐为民

(1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013；2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京210014；3.徐州荣炷食品有限公司，江苏徐州221000)

羊肉营养物质丰富，与猪肉相比脂肪含量和胆固醇含量都偏低，肉质软嫩可口，深受消费者的青睐[1-2]。但在羊肉加工、储藏、运输过程中，由于羊肉中维生素、矿物质以及蛋白质含量比较高，因此很容易受到一些食源性致病菌的污染[3-4]。金黄色葡萄球菌可以引起人类和动物的下呼吸道和手术部位感染，引发败血症和肺炎[5-6]。此外，金黄色葡萄球菌还具有较强的生物膜形成能力[7-8]。一旦生物膜形成，由于蛋白质、多糖和磷脂等大分子的存在，增加了不同抑菌手段对其进行有效抑制的难度[9]。因此，研究对金黄色葡萄球菌生物膜的高效抑菌方法以控制羊肉中金黄色葡萄球菌的生长就显得尤其重要。

有机酸被认定为一类安全、有效的抗菌剂[10]。乳酸作为三大有机酸中的一种，在抑制食品中微生物生长方面具有明显的作用。Anang等[11]报道了乳酸在延长鸡胸肉货架期方面具有明显的作用，它可以有效控制鸡胸肉中假单胞菌的菌群数量。Youssef等[12]报道了5%的乳酸可以使牛肉中大肠杆菌菌落数量减少4lg(CFU/g)以上。Li等[13]报道了2%的乳酸可以有效地减少鸡蛋壳上面肠炎沙门氏菌的数量。作为一种环保的非热杀菌方法，超声波得到了广泛的应用。但有研究结果表明，虽然超声波可很大限度地保留食品性质，但单独使用时抑菌效果不是特别明显[14]。因此，通常需要跟其他抑菌方法一起协同作用。毕秀芳等[15]报道了超声波联合乳酸链球菌素处理可以有效控制胡萝卜汁中菌群数量。盖作启[16]报道了超声波联合热处理可以有效控制牛奶中的微生物数量，且不会对牛奶品质产生任何不利的影响。Cichoski等[17]的研究结果表明，超声波联合酸性电解水处理鸡胸肉，可有效地减少鸡胸肉中嗜冷细菌、乳杆菌和中温菌的数量，且不会损坏鸡胸肉的感官品质。Yu等[18]报道了超声波联合二氧化氯处理可以协同有效地控制金黄色葡萄球菌生物膜的生长。然而，关于超声波联合乳酸处理的协同抗菌和抗生物膜机制以及超声波联合乳酸处理对羊肉中金黄色葡萄球菌菌落数控制的研究还未见报道。

因此，本研究以金黄色葡萄球菌为指示菌，分别研究超声波、乳酸以及超声波+乳酸对金黄色葡萄球菌游离和生物膜细胞菌落数的杀菌效果，并且对超声波+乳酸联合处理的协同抗菌和抗生物膜机制进行研究，以期降低乳酸的使用浓度。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

指示菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，为本实验室保存的菌种。脑心浸液肉汤(BHI)液体、BHI固体培养基，产自青岛海博生物科技有限公司。氯化钠，产自国药集团化学试剂有限公司。乳酸，产自南京寿德实验器材有限公司。NuncTMLab-TekTM8孔腔室盖玻片系统，产自赛默飞世尔科技公司。24孔聚氯乙烯培养板，产自美国康宁公司。羊肉，购自南京盒马网络科技有限公司。

BHC-1300IIA/B3型生物洁净安全柜，产自苏州净化设备有限公司。PE(Ultra View VOX)转盘式激光共聚焦显微镜，产自美国珀金埃尔默股份有限公司。EVO-LS10扫描电子显微镜，产自德国卡尔蔡司股份公司。KQ-800KD超声波清洗机，产自中国昆山超声波仪器有限公司。酶标仪，产自美国BioTek Instruments有限公司。Centrifuge 5810 R 离心机，产自德国Eppendorf公司。THZ-C台式恒温振荡器，产自太仓市华美生化仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的培养 将金黄色葡萄球菌菌液从-80 ℃保存条件中取出，在BHI培养基中37 ℃培养至对数期，然后重复此步骤，继续按照1%的接种量接种于BHI培养基中培养12 h，所得菌液用于后续操作[19]。

1.2.2 超声波、乳酸、超声波联合乳酸处理对金黄色葡萄球菌游离和生物膜细胞的杀菌作用 将对数期的金黄色葡萄球菌菌液离心(5 000g，10 min，4 ℃)后,去除上层培养基，将沉淀用0.85%生理盐水洗涤3次[20]。超声波(400 W，50 kHz)单独处理(US)时，向沉淀中加入等体积的0.85%生理盐水并充分混匀，置于超声波清洗机中。乳酸(LA)单独处理(质量分数为0.5%、1.0%)时，向沉淀中分别加入等体积的浓度为0.5%或1.0%的乳酸并充分混匀，在室温条件下进行杀菌处理。二者联合处理(US+0.5% LA、US+1% LA)时，向菌泥中加入等体积的0.85%生理盐水并充分混匀，然后置于超声波清洗机(400 W，50 kHz)中。此外，在室温条件下分别放置菌悬液作为对照组。所有处理均在5 min、10 min、20 min、30 min、60 min时取样、计数。迅速吸取1 ml的菌液与9 ml 0.1 mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)调节pH。将菌液稀释进行平板计数，培养条件为37 ℃静置24 h[21]。

根据Liu等[21]的方法，将菌液进行培养并活化，之后定量加到NuncTM24孔聚氯乙烯培养板中，随后将孔板在37 ℃静置培养3 d。培养过程中每隔完整的1 d更换BHI肉汤培养基，操作时先沿每个孔壁慢慢提取培养基，然后缓慢加入新鲜的培养基以保持细菌活性。培养3 d后，缓慢吸除上清液，用1 ml 0.01 mol/L PBS冲洗生物膜3次以备用。金黄色葡萄球菌生物膜的杀菌方法和菌落计数的方法参考金黄色葡萄球菌游离细胞的杀菌方法[21]。

1.2.3 生物膜胞外多糖含量的测定 参照文献[21]、[23]的方法测定生物膜胞外多糖含量。不同处理后，收集各孔中的生物膜细胞以测定其多糖含量。将对应于一个样品的3个孔的生物膜内容物混合并离心，取沉淀用于下一步操作，上清液用于测定可溶性多糖含量。将所得沉淀加入到含有0.85% NaCl及0.22%甲醛的溶液中，水浴30 min，温度为80 ℃，在4 ℃条件下离心30 min，转速12 000 r/min。

1.2.4 扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜分析 参考方法1.2.3，将经过US、1% CA和US+1% CA 处理30 min后的金黄色葡萄球菌菌悬液迅速与0.1 mol/L PBS混合，离心(6 000g，5 min，4 ℃)，在4 ℃用2.5%戊二醛固定至少12 h，用于扫描电子显微镜分析。此外，将离心后所获得的沉淀用LIVE/DEAD BacLightTM试剂在室内黑暗条件下进行染色处理30 min，然后再次离心(6 000g，5 min，4 ℃)，用0.85%生理盐水反复洗涤3次，用于激光共聚焦显微镜分析[22]。

生物膜的培养方法参考方法1.2.3，将活化后的菌液定量添加到8 孔腔室盖玻片中。培养结束后, 将生物膜分别用US、1% LA和US+1% LA处理30 min，然后移除上层溶液，将生物膜在超净工作台中自然风干。将风干后的生物膜按照网格线裁开，然后将样品在4 ℃下放置12 h，使其自然干燥，之后用1%四氧化锇固定2 h，再用2.5%戊二醛固定至少12 h，用扫描电子显微镜拍摄金黄色葡萄球菌生物膜细胞。将风干后的生物膜用LIVE/DEAD BacLightTM试剂在室温以及黑暗条件下进行染色处理30 min，然后用0.01mol/L PBS洗涤3次，将生物膜再次风干，并去除隔板[21-22]，用激光共聚焦显微镜拍摄金黄色葡萄球菌生物膜细胞。

1.2.5 核酸物质泄露的测定 参考方法1.2.3培养金黄色葡萄球菌游离和生物膜细胞。将经US、0.5% LA、1.0% LA、US+0.5% LA和US+1.0% LA不同处理30 min 后的菌体离心(4 ℃，3 000g，10 min)，取上清液测定其OD260值[24]。

1.2.6 超声波联合乳酸处理对羊肉中金黄色葡萄球菌的灭活作用及对羊肉pH的影响

1.2.6.1 羊肉的处理 将从超市买来的羊肉用无菌刀切成正方体形状，每份10 g。首先测定羊肉中原有的菌群数量，约为4lg(CFU/g)。然后将羊肉浸泡在含量为7lg(CFU/g)的金黄色葡萄球菌菌液中2 h, 最终测得羊肉上的金黄色葡萄球菌菌群数量约为6.11lg(CFU/g)。将羊肉用US+0.5% LA分别处理5 min、10 min、20 min、30 min、60 min。

1.2.6.2 微生物计数 按照国家标准进行菌落总数[25]以及金黄色葡萄球菌菌数[26]的测定。将10 g 肉放入均质袋中，在无菌条件下加入 90 ml 0.01 mol/L PBS，并放入4 ℃摇床振荡1 h。用0.85%生理盐水进行10倍连续稀释[27-28]，然后参照方法1.2.3进行微生物计数。

1.2.7 数据统计与分析 所有试验数据均为3次独立试验的平均值，表示为“平均值±标准差”。使用SPSS软件通过方差分析(ANOVA)进行统计分析。使用Origin 9.5软件进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 超声波、乳酸以及二者联合处理对金黄色葡萄球菌游离和生物膜细胞的杀菌效果

图1显示了超声波、乳酸以及二者联合处理对金黄色葡萄球菌不同菌体状态的杀菌效果。对照组中菌落数约为9lg(CFU/g)，US单独处理30 min时，分别仅使金黄色葡萄球菌游离和生物膜细胞菌落数降低了0.31lg(CFU/g)和0.22lg(CFU/g),这与Li等[29]的研究结果一致。400 W的US 处理15 min，仅仅使得金黄色葡萄球菌游离细胞的菌落数降低了0.31lg(CFU/g)。0.5% LA和1.0% LA的乳酸处理30 min, 金黄色葡萄球菌游离细胞的菌落数分别降低了1.82lg(CFU/g)和2.64lg(CFU/g)，金黄色葡萄球菌生物膜细胞的菌落数分别降低了1.02lg(CFU/g)和2.01lg(CFU/g)。Wang等[30]报道了0.5% LA可以完全有效地抑制肠沙门氏菌、大肠杆菌和单核增生性李斯特菌的生长。Omori等[31]报道了0.5% LA和1.0% LA可以有效地降低单核增生性李斯特菌的菌落数量。

超声波与乳酸联合处理(US+ LA)对菌体的抑菌作用明显增强。US+ 0.5% LA和US+1.0% LA处理30 min时, 金黄色葡萄球菌游离细胞的菌落数分别降低了2.73lg(CFU/g)和3.51lg(CFU/g)，金黄色葡萄球菌生物膜细胞的菌落数分别降低了1.96lg(CFU/g)和3.39lg(CFU/g)。当用US+LA处理时，US 通过自身的空化作用使菌体的细胞膜通透性增加，LA可以通过破损的细胞膜进入菌体细胞发挥抑菌作用，造成菌体细胞内的物质泄露，从而导致菌体细胞死亡。因此，二者联合处理具有明显的协同杀菌效果[14,18]。综上，US+0.5% LA 的杀菌效果和1.0% LA单独处理的杀菌效果相似。许愈等[32]的研究结果表明，超声波与酸性电解水联合处理可以有效地减少副溶血性弧菌的菌落数量。He等[33]报道了超声波与百里香精油纳米乳液联合处理可以提高对金黄色葡萄球菌的杀菌效果。

图1 超声波(US)、乳酸(LA)和US+LA处理对金黄色葡萄球菌游离(A)和生物膜(B)细胞的杀菌效果Fig.1 Bactericidal effect of ultrasound (US)，lactic acid (LA) and US +LA treatments on planktonic cells (A) and biofilm cells (B) of Staphylococcus aureus

2.2 生物膜胞外多糖含量的测定结果

由图2可见，与对照组相比，US、0.5% LA、US+0.5% LA处理使金黄色葡萄球菌生物膜中可溶性多糖含量分别降低16.20%、25.99%和34.43%，使不可溶性多糖含量分别降低16.30%、25.91%和40.33%，这表明与单独处理相比，超声波与乳酸联合处理可以使生物膜中所含的可溶性多糖与不可溶性多糖含量呈现显著下降的变化趋势。胞外多糖含量在生物膜胞外基质中占比最高，可使生物膜中的细胞黏附在一起，从而增强生物膜细胞对外界不良因素的干扰[34]。由于US破坏了生物膜的结构，导致黏附在一起的生物膜细胞出现孔隙，因此LA可以更好地通过生物膜的外层基质，进而提高对致病菌的杀灭作用[22]。US+0.5% LA处理后金黄色葡萄球菌生物膜中多糖含量与1.0% LA处理后的多糖含量无显著性差异，这进一步表明联合处理可以降低LA的使用浓度。

2.3 扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜分析结果

空白对照组的金黄色葡萄球菌游离细胞呈饱满的球状且表面光滑，激光聚焦电镜图片中未见有被染成红色的细胞，这表明所有细菌的细胞膜保持完整的状态，且通透性未发生改变(图3A1、图3B1)。US处理30 min 后，菌体表面出现褶皱，少部分细胞被染成红色(图3A2、图3B2)。1.0% LA处理30 min 后, 菌体表面开始出现凹陷，但大部分菌体依然保持完整的形态，被染成红色的细胞数量与US单独处理相比显著增加，这与微生物计数的结果相一致，LA单独处理的杀菌效果要比US单独处理好(图3A3、图3B3)。图3A4、图3B4结果表明，US+1.0% LA 可以对金黄色葡萄球菌游离细胞产生严重的损伤，大量细胞变得干瘪，被染成红色的细胞的比例与单独处理相比显著增加。

对照组的金黄色葡萄球菌生物膜细胞排列较紧密，生物膜厚度较大，且菌体结构完整，未受到破坏(图4A1、图4B1)。US处理30 min 后，有少数细胞呈现红色荧光，表明此时有少数细胞受到伤害(图4A2、图4B2)。与US单独处理相比，LA处理下呈现红色荧光的细胞数量明显增加，密集的生物膜逐渐被瓦解，菌体状态明显变化，褶皱增加(图4A3、图4B3)。图4A4、图4B4结果表明US+1.0% LA处理的生物膜细胞外部基质损害严重，生物膜开始变得疏散，大量菌体细胞表面变得凹陷。这与迟媛等[14]的研究结果一致，超声波协同次氯酸钠处理会加速菌体的死亡速度。许愈等[32]报道，超声波可损伤菌体的细胞壁，因此酸性电解水会更好地渗入细胞，从而使得菌体细胞遭到严重的破坏。

不同处理对应柱上标有不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图2 超声波(US)、乳酸(LA)和US+LA处理后金黄色葡萄球菌生物膜的可溶性多糖(A)与不可溶性多糖(B)含量Fig.2 Soluble (A) and insoluble (B) polysaccharide contents in Staphylococcus aureus biofilm cells after treated by ultrasound (US)，lactic acid (LA) and US +LA

图3 超声波(US)、乳酸(LA)和US+LA处理后金黄色葡萄球菌游离细胞的扫描电子显微镜与激光共聚焦电镜结果Fig.3 Scanning electron microscopy and laser confocal electron microscopy images of Staphylococcus aureus planktonic cells after treated by ultrasound (US)，lactic acid (LA) and US +LA

图4 超声波(US)、乳酸(LA)和US+LA处理后金黄色葡萄球菌生物膜扫描电子显微镜与激光共聚焦电镜图Fig.4 Scanning electron microscopy and laser confocal electron microscopy images of Staphylococcus aureus biofilm cells after treated by ultrasound (US)， lactic acid (LA) and US +LA

2.4 核酸物质泄露的测定结果

核酸物质的泄露量可以进一步反映菌体细胞膜的完整性和流动性变化。由图5可见，US单独处理后核酸的泄漏并不明显，而LA单独处理使得核酸的泄漏量明显增加，这与扫描电子显微镜(SEM)与激光共聚焦电子显微镜(CLSM)的结果相一致，LA可以对菌体的细胞膜造成严重损伤，进而增加细胞的损害程度。此外，US+LA处理后，核酸泄漏量急剧增加，原因为US+LA处理破坏了菌体细胞膜的完整性和通透性，造成内部物质大量泄露。许愈等[32]研究发现，超声波联合酸性电解水处理对细胞结构产生显著影响，与本研究结果一致。

不同处理对应柱上标有不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图5 超声波(US)、乳酸(LA)和US+LA处理后金黄色葡萄球菌游离和生物膜细胞的核酸泄露Fig.5 Release of nucleic acids in Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cells after treated by ultrasound (US)，lactic acid (LA) and US +LA

2.5 超声波联合乳酸处理对羊肉中金黄色葡萄球菌的杀菌效果

由图6可见，US+0.5% LA处理可以显著降低羊肉上金黄色葡萄球菌的菌落数量(P<0.05)。随着处理时间的增加，羊肉上金黄色葡萄球菌的菌落数量逐渐降低。US+0.5% LA处理60 min,可使羊肉上金黄色葡萄球菌的菌落数量较处理前降低1.97lg(CFU/g)。因此US+LA处理是一种良好的杀菌方式，它可以显著控制羊肉上金黄色葡萄球菌的菌落数量。毕秀芳等[15]报道了超声波联合乳酸链球菌素可有效控制胡萝卜汁中的微生物数量，且不影响胡萝卜汁的品质。Ramezani等[35]报道了乳酸联合壳聚糖以及气调包装可以显著延长鹌鹑肉的货架期。González-Fandos等[36]报道了乳酸和山梨酸钾可以有效地减少鸡肉上单细胞增生性李斯特菌的数量。

不同处理对应柱上标有不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图6 US+0.5% LA处理对羊肉上金黄色葡萄球菌的杀菌效果Fig.6 Bactericidal effect of US+0.5% LA treatment on Staphylococcus aureus of mutton

3 结论

US+LA协同处理的杀菌作用显著，二者联合处理时对致病菌的杀菌效果显著强于单独处理时的杀菌效果。经US+LA处理后，金黄色葡萄球菌生物膜细胞多糖含量显著降低，菌体细胞产生严重凹陷，细胞膜通透性增加，核酸泄露量显著增加(P<0.05)。此外，US+0.5%LA能显著降低羊肉上金黄色葡萄球菌的菌群数量。因此，US+LA是一种良好的杀菌方式，它可以降低LA的使用浓度。