丙泊酚和七氟醚麻醉对老年大鼠腹部术后认知功能的影响

范晓英 郑仲磊 张万平 薛沙

术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是全身麻醉后影响中枢神经系统功能的最常见的并发症之一，多发于老年人[1]。合理的麻醉方案有助于保护患者的中枢神经系统损害。涉及女性子宫附件及胃肠、肝胆和膀胱的手术均需要开腹，而麻醉和手术与患者POCD的发生密切相关。丙泊酚和七氟醚均是临床十分常用的麻醉维持药物，有研究报道，丙泊酚麻醉在脑部手术患者中具有较好的神经保护作用[2]。脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)是一种广泛表达于中枢神经系统的神经营养因子，其在神经元存活和分化以及突触可塑性中发挥关键作用[3]。BDNF的失调导致与创伤性脑损伤、脑缺血、神经退行性疾病及POCD密切相关[4,5]。本研究拟通过观察丙泊酚、七氟醚麻醉的腹部手术大鼠认知功能，检测海马炎性反应和氧化应激反应及BDNF的表达，揭示丙泊酚在老年患者腹部手术麻醉中减少认知功能损害的价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物 40只18月龄健康的清洁级SD大鼠(537±55)g购自上海斯莱克实验动物公司，合格证号：SCXK(沪)2021-0014。实验前1周进行(23±1)℃，(55±5)%湿度的环境下足料足水，常规昼夜饲养。

1.2 试剂与仪器 丙泊酚乳状注射液(国药准字：H20010368)购自西安力邦制药；七氟醚(国药准字号：H20080681)购自鲁南贝特制药；戊巴比妥钠购自美国Sigma公司；人白介素1β(IL-1β)检测试剂盒、白介素6(IL-6)检测试剂盒、肿瘤坏死因子α(TNF-α)检测试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒均购自上海碧云天；兔抗BDNF多克隆抗体(28205-1-AP)、兔抗β-actin单克隆抗体(4970)、HRP标记的山羊抗兔二抗均购自美国Cell Signaling Technology；实验动物用气体麻醉机购自美国EZSystems；IQ-1000 多功能气体检测仪购自美国IST；YH-MWM Morris水迷宫实验系统购自武汉一鸿科技公司；XR-XZ301型旷场实验视频分析系统购自上海欣软信息科技公司。Spark多功能酶标仪购自上海帝肯贸易公司；ChemiDocXRS+凝胶成像系统购自美国Bio-rad。

1.3 麻醉与分组 40只大鼠随机分为丙泊酚组、七氟醚组，每组20只。

1.3.1 丙泊酚组：大鼠进行腹腔注射丙泊酚100 mg/kg麻醉，行开腹手术，关闭腹腔。

1.3.2 七氟醚麻醉需要带有钠石灰的密闭透明麻醉箱，进气孔与实验动物用气体麻醉机连接，出气孔与气体监测仪连接，监测七氟醚的浓度。

1.3.3 处理：待大鼠自由苏醒，可行走1 d。从2组大鼠中各选4只，注射戊巴比妥麻醉，断颈法处死大鼠，无菌分离海马，-80℃保存，备用。

1.4 Morris水迷宫实验[6]大鼠在进行麻醉前每天进行学习训练，连续5 d，4次/d，每次间隔20 min。第6天对大鼠进行麻醉手术。待大鼠苏醒且可行走后1 d，进行逃避潜伏期、游泳距离测试。连续5 d，4次/d，每次间隔20 min。通过水迷宫视频跟踪分析系统记录大鼠1 min内找到水下平台的时间(逃避潜伏期)及游泳路线距离(cm)，以进行评估。

1.5 旷场实验 剩余8只大鼠，放在准备好的矿场分析箱中央格内，大鼠自由活动5 min。通过图像跟踪监视系统记录大鼠的路程、理毛次数、站立次数(离地>1 cm)和跨格次数(3个肢体跨入)。每次结束后，避免气味残留，需乙醇擦拭。

1.6 酶联免疫吸附实验 取部分大鼠海马组织，加入2倍体积的双蒸水，无菌研磨。分装置2 ml的EP管，离心，取上清进行炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)，氧化应激因子(MDA、SOD)的含量检测。具体检测的操作步骤严格按照试剂盒的说明书操作，判定标准确定样本中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、SOD的含量。

1.7 蛋白免疫印迹实验 无菌研磨大鼠海马组织，加入3倍体积的RIPA裂解液，冰上充分裂解。提取组织总蛋白，测定蛋白浓度并变性。将变性蛋白上样行SDS-PAGE电泳，再将蛋白湿转至PVDF膜。用含有2.5%脱脂奶粉的封闭液37℃孵育2 h。充分洗膜3次，浸入稀释过的一抗溶液(兔抗BDNF多克隆抗体，1∶1 000；兔抗β-actin单克隆抗体，1∶2 000)，4℃孵育过夜。同样洗膜，浸入稀释过的二抗溶液(HRP标记的山羊抗兔二抗，1∶500)，37℃孵育2 h。洗膜后用ECL发光液显影曝光。Image J软件分析蛋白灰度，用目的蛋白的灰度值与内参β-actin的灰度值之比表达蛋白的相对表达。

2 结果

2.1 2组大鼠Morris水迷宫实验结果比较 丙泊酚组、七氟醚组大鼠剖腹术前第1、3、5天的逃避潜伏期和游泳距离差异无统计学意义，术后丙泊酚组大鼠第1、3、5天的逃避潜伏期和游泳距离均显著低于七氟醚组(P<0.05)。见表1、2。

表1 2组腹部手术大鼠逃避潜伏期比较

表2 2组对腹部手术大鼠游泳距离比较

2.2 2组腹部手术大鼠矿场实验比较 2组大鼠术后第1天的理毛、站立、跨格的次数差异无统计学意义，第5天的理毛、站立、跨格的次数丙泊酚组显著高于七氟醚组(P<0.05)。见表3。

表3 2组对腹部手术大鼠矿场实验比较 n=20，次,

2.3 2组对腹部手术大鼠海马炎性反应比较 丙泊酚组IL-1β、IL-6、TNFα、MDA含量均显著低于七氟醚组，SOD的含量显著高于七氟醚组(P<0.05)。见表4。

表4 丙泊酚、七氟醚对腹部手术大鼠海马炎性因子IL-1β、IL-6、TNFα、MDA、SOD含量比较

2.4 2组对腹部手术大鼠海马BDNF蛋白表达比较 丙泊酚组大鼠海马中BDNF的蛋白表达量显著高于七氟醚组(P<0.05)。见图1，表5。

图1 BDNF蛋白电泳图

表5 2组腹部手术大鼠海马BDNF蛋白相对表达量

3 讨论

有学者认为，在一定情况下，麻醉药可能对各种神经损伤具有保护作用，当然也有研究者认为麻醉药可能具有神经毒性，如引起淀粉样β的沉积[7,8]。不同的麻醉药对大脑的影响及其在不同患者群体和临床环境中的功能仍不确定，因此麻醉药的选择对患者认知功能的恢复非常重要。异丙酚可引起发育期大鼠的大脑神经元细胞的死亡，但对老年大鼠脑神经细胞具有保护作用[8]。Zhang等[9]研究发现，术后3个月异丙酚麻醉患者发生认知功能障碍的概率明显低于七氟醚麻醉，术后第2天异丙酚麻醉患者的QoR-40总体评分显著高于七氟醚麻醉[10]。刘蕊池[11]在探究丙泊酚与七氟醚麻醉对颅脑损伤患者术后认知功能的研究中报道，丙泊酚麻醉的患者血清脑损伤标志物、应激指标和MMSE评分均显著低于七氟醚麻醉患者。Tang等[12]研究发现异丙酚可有效改善术后认知功能并降低不良反应的风险。

在一项关于接受腹腔镜胆囊切除术老年患者的麻醉药比较的研究中显示，相较于七氟醚或异氟醚麻醉，接受异丙酚麻醉的患者在术后第1天和第3天发生认知功能障碍者显著降低，血浆中S-100β和Aβ1-40蛋白及IL-1β、IL-6和TNF-α浓度均显著降低，说明了异丙酚在老年患者腹腔手术麻醉中有很大优势[13]。本研究发现，丙泊酚麻醉的大鼠逃避潜伏期和游泳距离明显降低，大鼠的理毛、站立、跨格的频率也明显升高，充分说明了在进行腹部手术时丙泊酚麻醉优于七氟醚，同时丙泊酚麻醉的大鼠海马IL-1β、IL-6、TNFα和MDA的浓度均显著降低，SOD的浓度显著升高，这也说明了丙泊酚麻醉能够降低大鼠认知功能损伤的潜在机制。

BDNF是一种在神经可塑性中起重要作用的神经营养因子，其在术后认知功能障碍中也具有关键作用[14]。Xie等[15]在研究BDNF与术后患者认知功能障碍关系的研究中报道，在术后7 dBDNF rs6265位点携带G等位基因的患者发生认知功能障碍的风险低于A等位基因携带者，而在术后3个月则相反，揭示了BDNF rs6265多态性可能与术后7 d认知功能障碍的发生有关，rs6265位点的A>G突变可能是中国汉族人群早期认知功能障碍的保护因素。BDNF/TrkB信号通路的活性在术后老年小鼠体内受到抑制，并且这是小鼠术后发生认知功能障碍的重要机制[16]。为了探索麻醉药丙泊酚和七氟醚对BDNF是否具有影响，本研究通过WB法检测大鼠海马中BDNF的蛋白表达发现，丙泊酚麻醉大鼠海马中BDNF的蛋白表达显著高于七氟醚麻醉大鼠海马。此研究结果更说明丙泊酚麻醉对神经损伤的潜在保护作用，揭示了丙泊酚麻醉对临床腹部手术的老年患者的意义。

总之，丙泊酚在老年大鼠腹部手术麻醉中可降低炎性和氧化应激反应，增强BDNF的神经保护作用，减轻认知功能的损害，值得临床的老年人腹部手术中进行推广。