miR-205-5p负靶向调控血管内皮生长因子A对子宫内膜异位症的影响

闵逸飞，应小燕

0 引 言

子宫内膜异位症是一种良性的妇科炎症性疾病，子宫内膜组织异常，育龄妇女发病率高，高达10%[1]。流行病学研究结果显示，育龄妇女子宫内膜异位症的发病率高达15%，全球患者数量超过2亿，近年来发病率逐年上升。治疗方案主要是药物治疗和手术治疗，但药物治疗的不良反应普遍比较大，手术治疗风险高，并发症多[2]。有文献报道，miRNAs在乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌等多种妇科疾病中起调控作用，但在子宫内膜异位症中的研究较少[3-5]。miR-205-5p在子宫内膜异位症患者中表达降低，且通过靶向子宫内膜基质细胞中的 ANGPT2 抑制人类子宫内膜异位症的进展[6]，但其作用机制尚不完全清楚。众所周知，miRNAs通常与其靶mRNA共同作用，通过mRNA的降解影响癌症的发生发展[7]。血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)属于血小板衍生生长因子(PDGF)/血管内皮生长因子(VEGF)家族，以二硫键连接的同二聚体形式存在[8]。此外，VEGFA可诱导血管生成，促进内皮细胞生长和转移，抑制细胞凋亡，并参与内皮细胞的生理和病理生物学过程[7]。本研究旨在探讨miR-205-5p通过靶向VEGFA对子宫内膜异位症患者异常表达的影响机制，为子宫内膜异位症的治疗提供理论的依据。

1 材料与方法

1.1 临床样本收集2019年8月-2020年12月因良性妇科疾病在南京医科大学附属常州第二人民医院60例行子宫切除术患者的组织和血清样本，将患者样本分为子宫内膜异位症(EC)组(n=30)与正常子宫内膜(EN)组(n=30)，接受激素治疗或同时患有恶性肿瘤的患者被排除在外。本研究经南京医科大学附属常州第二人民医院伦理委员会批准(伦理批准号：[2019]YLB016)。

1.2 主要试剂与设备RIPA裂解液(KL131008250)和双荧光素酶报告试剂盒(RG027)及Tunel试剂盒(C1098)均购自上海碧云天生物科技有限公司。Trizol试剂盒(15596-026)购自Invitroge。荧光定量PCR仪(7300)购自美国ABI公司，显微镜是上海光学仪器厂生产。

1.3 子宫内膜基质细胞获取及处理收集子宫内膜组织，用PBS冲洗3次，用无菌眼剪切破碎，加入5 mLI型胶原酶(1 mg/mL)，在37 ℃培养箱中消化60 min，每20 min搅拌一次。然后将混合的细胞悬液通过200和400目不锈钢细胞过滤器进行过滤。然后在DMEM/F-12培养基和37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

使用免疫细胞化学荧光染色鉴定子宫内膜基质细胞纯度。用0.3%Triton-X-100 37 ℃孵育30 min，4%甲醛固定30 min，用5%牛血清白蛋白室温封闭20 min，然后用波形蛋白一抗(ab8978和Abcam)抗体4 ℃过夜。使用一抗孵育之后，分别采用0.3%Triton-X-100和PBS冲洗3～4次，加入一抗所对应的二抗，37 ℃的环境下孵育40 min。最后，加入100 μL 4,6-生物胺-2-苯甲酰(DAPI)15 min，冲洗，甘油密封，荧光显微镜观察。

使用转染技术在子宫内膜基质细胞中转染miR-205-5p模拟，将细胞分为NC模拟组、miR-205-5p模拟组、NC模拟+质粒组、miR-205-5p模拟+质粒组和miR-205-5p模拟+VEGFA组。

1.4 实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测mRNA的表达量利用RT-PCR技术检测组织、细胞和血液样本中miR-205-5p的表达。使用Trizol试剂提取组织、细胞和血液样本中的总RNA。使用SYBRGreen定量PCR试剂盒完成PCR反应，反应的体系及反应的条件，均按照试剂盒的说明进行实验，并放置实时荧光定量PCR仪进行扩增，并采用2-ΔΔCt计算相关因子的表达量。

1.5 CCK-8细胞增殖实验将不同方法处理的细胞接种于96孔的反应板中，接种后，分别于24 h、48 h、72 h后加入CCK-8的溶液，并放置酶标仪中进行检测。

1.6 采用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(Edu)法检测细胞增殖情况将细胞浓度调整到1×106/mL，以每孔500 μL接种于，预覆盖玻片的24孔板中，培养基每3 d更换一次。在每个设定时间点前2 h，加入50 μLEdU培养物，冲洗细胞，加入细胞固定液。按照EdU试剂盒的说明书进行染色，并拍照并计数。

1.7 蛋白印迹法检测增殖和凋亡相关蛋白的表达采用蛋白印迹法检测增殖[增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki67]相关蛋白和凋亡(Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9)相关蛋白的表达水平。加入含PMSF(Bio-Rad)的细胞裂解液，冰下裂解细胞20 min，4 ℃，离心5 min，收集上清液，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，进行蛋白定量。10%SDS-PAGE电泳，转膜上，5%的脱脂奶粉封闭，加入一抗，4 ℃孵育过夜。加入一抗对应的二抗孵育2 h，用TBST洗涤显影。利用ImageJ软件对其灰度值进行分析。

1.8 细胞凋亡根据凋亡试剂盒说明，在不同方法处理的细胞中加入缓冲液，将细胞悬液转移到含有5 μL AnnexinV/FITC和10 μL碘化丙啶的流动管中，室温孵育0.5 h，流式细胞术分析。

1.9 划痕实验将不同方法处理的细胞接种于6个孔的反应板中，培养24 h。当细胞满85%时，使用微采样器垂直交叉，PBS洗涤，加入基础培养基，在37 ℃，5%CO2培养箱中培养。观察并记录了细胞的迁移情况。使用ImageJ软件从6～8条水平线中计算细胞间距离的平均值。

1.10 Transwell实验在Transwell上室中加入200 μL不同方法处理的细胞悬液，下室中加入600 μL10%胎牛血清培养基。孵育24 h后，固定中性甲醛，染色1%结晶紫，显微镜下计算NC模拟组、miR-205-5p模拟组、NC模拟+质粒组、miR-205-5p模拟+质粒组和miR-205-5p模拟+VEGFA组细胞数量。

1.11 双荧光素酶报告基因实验使用双荧光素酶检测试剂盒(Promega)检测细胞中荧光素酶的反应强度，使用相对荧光素酶活性(%)表示丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)基因的表达水平。

1.12 统计学分析采用SPSS 22.0进行数据分析，使用配对t检验比较miR-205-5p在正常和异位子宫内膜组织和血清中的表达差异。使用非配对t检验比较两组独立样本之间的差异性。使用单因素方差分析两组及以上的差异性。使用双因素方差分析CCK-8实验不同组间的差异性。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-205-5p在组织和血液中的表达与正常子宫内膜(EN)组相比，子宫内膜异位症(EC)组患者的组织和血液中miR-205-5p的表达明显降低(P<0.01)，见图1。

a：组织样本；b：血液样本

2.2 子宫内膜基质细胞纯度检测培养24 h后，细胞大多数呈梭形，细胞生长达满视野需要7 d，传代后细胞生长达满视野需要3 d。通过免疫荧光鉴定出两种细胞的特性，波形蛋白(vimentin)阳性是基质细胞，角蛋白(cytokeratin)阳性是上皮细胞，见图2。

图2 Vimentin/Cytokeratin免疫荧光染色鉴定分离的子宫内膜基质细胞(×400)

2.3 miR-205-5p对异位子宫内膜基质细胞增殖和凋亡的影响RT-PCR结果显示，转染miR-205-5p模拟后，miR-205-5p的表达显著提高(P<0.01)。CCK8、EdU和Western Blot实验结果表明，与NC模拟组相比，miR-205-5p模拟组细胞活力和增殖下降(P<0.01)，细胞中增殖相关蛋白(PCNA、Ki67)水平降低(P<0.01)。提示miR-205-5p显著抑制子宫内膜基质细胞的增殖和活力。见图3。

a：RT-PCR验证转染效率；b：CCK-8检测细胞活力；c：EdU检测细胞增殖；d：Western blot检测增殖相关蛋白

流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，与NC模拟组相比，miR-205-5p模拟组细胞凋亡增加(P<0.01)。Western blot结果显示凋亡相关蛋白(Bax、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9)表达升高(P<0.01)，Bcl-2表达降低(P<0.01)。提示miR-205-5p促进子宫内膜基质细胞凋亡。见图4。

a:流式细胞仪检测细胞的凋亡；b:Western blot检测细胞凋亡相关蛋白

2.4 miR-205-5p对异位子宫内膜基质细胞迁移侵袭的影响进一步使用划痕实验和Transwell来检测miRi-205-5p过表达对子宫内膜基质细胞迁移和侵袭的影响。结果显示，miR-205-5p模拟组子宫内膜基质细胞的迁移和侵袭能力明显降低(P<0.01)。与NC模拟组相比，miR-205-5p组的迁移和侵袭相关蛋白(Cox-2、MMP-2和MMP-9)的表达水平显著降低(P<0.01)。提示miR-205-5p可抑制子宫内膜基质细胞的迁移和侵袭。见图5。

a：迁移实验检测细胞的迁移能力;b:Transwell检测细胞的迁移和侵袭能力;c:Western blot实验检测迁移与侵袭相关蛋白

2.5 miR-205-5p的下游靶基因筛选及鉴定结果使用生物信息学来预测miR-205-5p的结合位点，见图6。并使用双荧光素酶报告基因分析来验证VEGFA是miR-205-5p的靶点，见图7。与健康个体相比，子宫内膜异位症组织中VEGFA的表达明显增加(P<0.01)，见图8，提示miR-205-5p可能负调控VEGFA。RT-PCR和免疫印迹检测显示，过表达miR-205-5p后，子宫内膜基质细胞中VEGF的表达水平显著降低(P<0.01)，见图9、图10。这表明VEGFA是miR-205-5p的一个靶点，并受到负调控。

图6 生物信息学预测miR-205-5p 的靶标

*P<0.01

*P<0.01

*P<0.01

*P<0.01

2.6 拯救实验探索miR-205-5p和VEGFA对子宫内膜基质细胞的影响的结果RT-PCR结果显示，转染过表达VEGFA质粒后，VEGFA在细胞中的表达显著升高;CCK8和EdU实验结果表明，与miR-205-5p模拟+质粒组相比，miR-205-5p模拟+VEGFA组的细胞活力和细胞增殖显著升高(P<0.01);见图11。

a:RT-PCR检测VEGFA的表达;b:CCK-8检测细胞活力;c:EdU检测细胞增殖

流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，与miR-205-5p模拟+质粒组相比，miR-205-5p模拟+VEGFA组的细胞的凋亡显著降低(P<0.01)，见图12。提示VEGFA的过表达可以逆转miR-205-5p过表达引起的细胞的凋亡升高。

与NC模拟+质粒组相比，*P<0.01；与miR-205-5p模拟+质粒组相比，#P<0.01

Transwell和划痕实验结果表明，与miR-205-5p模拟+质粒组相比，miR-205-5p模拟+VEGFA组的细胞的迁移和侵袭能力显著降低，见图13。提示VEGFA的过表达可以逆转miR-205-5p过表达引起的细胞增殖、迁移和侵袭能力的降低，以及细胞凋亡的升高。即miR-205-5p通过负调控VEGFA抑制细胞的增殖，迁移和侵袭，降低细胞的活力，促进细胞的凋亡。

a:Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭；b:划痕实验检测细胞的迁移

3 讨 论

子宫内膜异位症(EM)是一种与雌激素相关的慢性良性妇科疾病，主要症状为痛经、盆腔疼痛，可引起不孕，育龄妇女较高，易复发，并发症较多[9]。EM具有生长迅速、侵袭性强、多器官转移等类似恶性肿瘤的特点。关于其发病机制有多种理论，但其发病机制尚不清楚[10-11]。

微小RNA(miRNA)是一组由18～25个核苷酸组成的非编码单链RNA，在转录调控后水平调控相关基因的表达中起关键作用[12]。有文献报道miRNA在多种细胞过程中发挥关键作用，影响肿瘤细胞的分化、凋亡、迁移[13-14]。研究发现，肺癌、肝癌、乳腺癌等常见的恶性肿瘤的发生可能与miRNA的异常表达有关[1]。有文献研究发现，在子宫内膜异位症患者中，miR-34a-5p和AKT1基因的表达水平在子宫内膜组织中呈负相关，提示miR-34a-5p可能通过靶向AKT1基因影响子宫内膜基质细胞的增殖和自噬，并影响细胞的迁移及侵袭能力，进而影响子宫内膜异位症的发病[15-16]。miR-205-5p在子宫内膜异位症患者的组织和血清中的表达与健康者相比显著降低[6]。

为了进一步研究miR-205-5p对基质细胞的增殖凋亡的影响。本研究采用转染技术，以子宫内膜基质细胞为研究对象，转染miR-205-5p模拟，过表达miR-205-5p。结果显示，过表达miR-205-5p后，细胞活力和细胞增殖降低，相反，细胞的凋亡增加。Ki67和PCNA属于肿瘤细胞的增殖因子[17-18]，可以作为指标来评估细胞的增殖状态[19-20]。Bcl-2、Bax、裂解半胱天冬3和裂解半胱天冬9蛋白是细胞凋亡的重要因素，Bcl-2表达升高提示抑制凋亡，而Bax、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达升高可促进凋亡[21-22]。过表达miR-205-5p后细胞的增殖相关蛋白(PCNA、Ki67)水平降低，凋亡相关蛋白(Bax、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9)的表达升高，Bcl-2的表达下降。提示miR-205-5p促进子宫内膜基质细胞的凋亡，抑制其增殖和活力。

细胞的迁移和侵袭是一个复杂过程，受黏附因子的调控，从而实现在体内的迁移和侵袭[23-24]。文献报道表明，环氧化物酶Cox-2可上调MMPs的表达，促进肺腺癌细胞的增殖和侵袭[25]。在子宫内膜异位症的研究中，MMP-9和 MMP-2可以作为子宫内膜异位症组织或者细胞侵袭能力检测指标之一[26]。本研究结果表明，miR-205-5p过表达抑制子宫内膜基质细胞迁移与侵袭相关蛋白(Cox-2、MMP-2、MMP-9)的表达。提示miR-205-5p降低子宫内膜基质细胞的迁移和侵袭能力。

先前研究发现VEGFA在子宫内膜异位症组织和细胞中显著高表达，miR-17-5p可以通过负调控VEGFA的表达来抑制子宫内膜异位症中的细胞增殖、迁移和侵袭[7]。本研究进一步研究证实VEGFA的过表达可以逆转miR-205-5p过表达引起的细胞增殖的降低，细胞迁移和侵袭能力的降低。

综述所述，miR-205-5p通过负调控VEGFA抑制细胞的增殖，降低细胞的活力，促进其凋亡，同样降低细胞的迁移和侵袭能力。