新型四倍体水稻创制及其杂种优势利用研究进展

刘向东 吴锦文 SHAHID Muhammad Qasim

（1. 华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广州 510642；2. 广东省植物分子育种重点实验室，广州 510642；3. 华南农业大学农学院，广州 510642）

多倍体植物在自然界中广泛存在。据不完全统计，自然界中50%-70%的被子植物，包括许多重要的农作物曾发生一次或多次多倍化［1-2］。多倍体植物具有生长健壮、抗逆性强、果实大和营养成分高等优点，创制和利用多倍体是植物育种的重要途径之一［3-6］。由我国创制并在青藏高原大面积种植的八倍体小黑麦就是多倍体育种的一个成功案例。

水稻是世界上最主要的粮食作物之一。目前生产上大面积推广的水稻是二倍体，尚没有多倍体推广应用［3］。已报道的多倍体水稻主要是指由二倍体水稻通过染色体加倍而形成的同源四倍体水稻［7-8］。与其他多倍体植物一样，同源四倍体水稻表现为籽粒增大、蛋白质含量提高［9］、耐盐性和抗性增强［10-13］等特点。此外，同源四倍体水稻杂种F1具有明显的杂种优势，其后代可产生与二倍体不同的基因重组，可为创造稀有材料及优良新品种提供一种新途径［14-16］。因此，开展多倍体水稻研究对于开辟水稻育种新途径及其相关基础研究具有重要意义［2-5，14-21］。

1 同源四倍体水稻研究概况

同源四倍体水稻研究可追溯到20世纪30年代。日本于1933年最早报道了自然形成的同源四倍体水稻，次年又通过人工加倍二倍体水稻获得了同源四倍体水稻。1950-1960年期间，日本科学家开展了同源四倍体水稻及其杂种细胞的遗传学研究并取得了一些有价值的结果，发现杂种F1育性提高，染色体配对异常率比亲本低［7］。但1960年以后至今，国外（包括日本在内）有关同源四倍体水稻的研究报道却不多。

我国自1951年开展四倍体水稻的研究，1956年报道诱导出同源四倍体水稻，并研究发现同源四倍体水稻育性普遍偏低，但籼型和粳型同源四倍体水稻杂交F1育性明显提高，可能具有应用前景［8］。20世纪80-90年代期间，我国科学家通过杂交育种结合花药培养技术，选育出同源四倍体水稻优良无性系并在生产上试种，其中有些品系产量超过二倍体水稻［9］。20世纪90年代以后，国内陆续有多家单位开展多倍体水稻研究，并取得重要进展，主要表现为以下3方面：

（1）建立了高效的秋水仙碱诱导加倍技术，创制出一大批不同类型携带优异基因的同源四倍体水稻材料，包括携带广亲和基因、质核互作和光温敏核雄性不育基因、无芒基因的同源四倍体水稻，以及携带“籼粳杂种F1花粉不育”基因的同源四倍体水稻近等基因系等［5，22-23］。培育出同源四倍体水稻光温敏核雄性不育系［24］，组配出同源四倍体水稻强优组合［25-26］。涂升斌等［25］报道建立了水稻同源四倍体的杂种优势利用技术体系，选育出同源四倍体水稻雄性不育系近千份、保持系和恢复系各20多份，组配出T462A×T4509强优组合，成功地通过三系配套实现了四倍体水稻杂种优势利用。

（2）阐明同源四倍体水稻低育性的细胞学和分子遗传学原因。研究发现，同源四倍体水稻花粉母细胞减数分裂期间染色体行为普遍存在异常现象，花粉和胚囊发育过程、受精、胚胎和胚乳发育过程中均存在不同程度的异常现象，这些异常都可能是引起同源四倍体水稻育性偏低的细胞学原因［27-33］。在分子遗传层面，与二倍体水稻原种比较，同源四倍体水稻花粉和胚囊发育期间育性相关基因存在异常表达、甲基化程度改变和非编码RNA（包括lncRNA和miRNA等）的异常表达等［29-30，34-37］。比如，同源四倍体水稻减数分裂相关的基因OsDMC1、OsMS2、PAIR2和OsMTOPVIB等，以及小孢子发育期间糖代谢相关基因OsSUT5和OsMST8等均表现下调表达［23，30］。Wu 等［22］发现同源四倍体水稻杂种花粉不育基因多座位（SaiSaiSajSaj、SbiSbiSbjSbj和SciSciScjScj）互作在多倍性的遗传背景下具有类似“上位性”的加强效应，可引起包括RAD51和泛素E3连接酶OsPUB73等基因在内的减数分裂期相关基因的表达显著下调，使花粉母细胞在减数分裂期就出现明显异常，进一步引起小孢子发育异常，最终使杂种花粉高度不育，较好地解释了同源四倍体水稻杂种育性偏低的分子遗传原因。值得一提的是，花粉育性“中性基因”可以克服多座位互作引起的不育性，为同源四倍体水稻亚种间的杂种优势利用提供了可能［23，28，38］。此外，Wu 等［15］发现同源四倍体水稻杂种后代发生了广泛的、个性化的部分同源交换（HE），引起部分同源染色体片段的拷贝数变化，进而影响已知功能基因及其互作，使多倍体群体水平表型产生多样性，增强其进化潜力。

（3）创制（培育）了高育性四倍体水稻新材料。我国科学家为了解决同源四倍体水稻育性偏低的瓶颈问题，经过多年努力创制出高育性的四倍体水稻新材料［21，39-40］。其中，研究较多的分为两类：一类是“减数分裂稳定多倍体水稻”（polyploid meiosis stability，PMeS，以下简称“PMeS 水稻”）［5，39，41-42］。PMeS水稻的育性超过65%，其与同源四倍体水稻杂交，F1结实率超过70%；经进一步改良后育性可达到80%以上［5，39］。拟南芥同源基因MND1在PMeS水稻减数分裂过程中起了重要作用［43］。第二类便是新型四倍体水稻（neo-tetraploid rice）［17，40，44-45］。

2 新型四倍体水稻创制过程及主要特点

新型四倍体水稻是通过同源四倍体水稻Jackson-4x（美国稻Jackson加倍获得同源四倍体水稻，由中国科学院华南植物园黎垣庆提供）与96025（中国农科院作物所选育，赵开军提供）进行杂交，并经过多年多代选育而成［17］。其中华多1号和华多2号两个品系分别于2009年和2010年育成，2016年获得国家植物新品种权［17］。由于该多倍体水稻既不同于由二倍体水稻直接加倍获得的同源四倍体水稻，也不同于异源四倍体水稻。所以，我们参照新型四倍体拟南芥（neo-tetraploid Arabidopsis）的表述［46］，于 2017年首次以“neo-tetraploid rice”（中文“新型四倍体水稻”）在国际学术刊物上报道了新型四倍体水稻华多3号［40］。此后，又报道了 华 多 1 号［47］、 华 多 2 号［17，45］、 以 及 华 多 4-8号［44，48］。其中，华多8号是一份长穗型并具有广亲和基因的新型四倍体水稻［44］。新型四倍体水稻主要有以下5方面特点：

（1）育性高。新型四倍体水稻育性高达80%［17，23，40，44-45］，而同源四倍体水稻的育性一般在0-70%之间波动，参数在50%以下。

（2）新型四倍体水稻携带多种优异基因，包括广亲和基因、花粉育性“中性基因”和高育性基因等，可以作为多倍体水稻育种的骨干亲本［23，44］。

（3）新型四倍体水稻基因组中存在丰富的DNA变异。其中，最有特点的是两类，一类是非亲本型的变异基因（non-parental genes），也就是在杂交的高代材料中，产生双亲都没有的变异位点（基因）。例如，在13份新型四倍体水稻中共检测到222个非亲本型的变异基因［45］；第二类是全新等位变异基因，即存在与二倍体水稻和同源四倍体水稻完全不同的新等位变异，如热激蛋白新等位变异基因“HSP101-1”等［49］。

（4）新型四倍体水稻类型独特。Yu等［49］通过PCA（principal components analysis）、系统发育和ADMIXTURE的群体结构分析，发现新型四倍体水稻具有与同源四倍体水稻和二倍体水稻不同的变异基因，分类属于独立的亚群，偏粳但与典型粳稻分属不同的亚群。

（5）新型四倍体水稻杂种优势强且可保持多代。新型四倍体水稻与籼型同源四倍体水稻杂交F1育性高达90%，产量超亲优势十分明显，部分杂交组合的超亲优势大于140%，产量可超过二倍体水稻推广品种黄华占。新型四倍体水稻杂种后代（F2-F5）仍可以保持高育性和较高的产量优势［44］，显示出该四倍体水稻在杂种优势利用，特别是多代优势利用上具有广阔的应用前景。

3 新型四倍体水稻杂种优势及其分子遗传研究

新型四倍体水稻的杂种F1不仅具有生物学优势，而且还表现出明显的产量优势。自2016年以来，本团队利用新型四倍体水稻与不同类型四倍体水稻杂交并组配了超过70个组合，发现杂种F1优势明显，其中包括单株实粒数、结实率和单株产量的中亲优势均达到显著水平，超亲优势也十分明显。统计其中53个组合的杂种优势发现，实粒数、结实率和单株产量中亲优势平均值分别为84.41%、32.94%和106.58%；超亲优势平均值分别为59.27%、13.83%和75.82%［40，44］。新型四倍体水稻与籼型同源四倍体水稻杂交F1的产量优势显著高于与粳型同源四倍体水稻杂交F1的优势，这可能与新型四倍体水稻偏粳型有关。其中，4001-4x×华多8号和Bengal-4x×华多8号两个组合的理论产量均超过二倍体水稻推广品种，应用潜力较大［44-45］。利用同源四倍体水稻增城丝苗-4x与新型四倍体水稻华多8号组配的杂种F1，其粒型和外观均偏向丝苗米，表现出籽粒细长、米粒外观透明，有望培育出优质四倍体杂交稻。

为揭示新型四倍体水稻杂种优势的分子遗传机理，本团队先后利用4个杂种F1及其双亲进行转录组研究，发现新型四倍体水稻杂种优势的产生主要涉及 6 类基因的差异表达［23，40，44］：

（1）与育性相关基因的上调表达，包括花粉发育相关基因，如DPW和CYP703A3基因等。这些基因的上调表达可能是杂种F1高育性的原因之一［23，40，44］。

（2）能量物质合成相关基因的上调表达，包括淀粉合成酶和糖代谢基因等。如MUT5和MTS8等基因在杂种F1高表达，OsBEIIb和OsSSIIIa在杂种F1开花后 3 d 的籽粒中表达上调［23，44］。

（3）编码NBS-LRR抗病蛋白或LRR受体样蛋白激酶基因。比如在（T485×H8）F1和（H1×H8）F1两个组合中，共检测到714个差异表达的已知基因，其中涉及抗性或耐受相关基因为66个［44］。

（4）转录因子（TF）等。以上两个组合共检测到76个特异表达的 TF［44］。

（5）与产量相关的QTL。以上两个组合共检测到109个差异表达基因位于7个产量性状相关QTL区间［44］。

（6）与杂种优势相关的已知基因等。以上两个组合检测到一些与杂种优势相关的差异基因，包括NAL1、Gn1a、qGW8、OsGA20ox1、Ghd8、GW6a、LP1 和 EUI1、i-sd-1（t）、sd1、OsGA20ox2 和 qSD1-2（dee-geo-woo gen dwarf）、DEP1、DN1、qPE9-1 和qNGR9（密穗）等，说明与二倍体杂交稻杂种优势相关的基因很可能在四倍体水稻杂种优势中也发挥作用［44］。

此外，研究还发现新型四倍体水稻杂种的差异表达基因具有特异性，即存在与二倍体杂交稻不同的差异表达基因。新型四倍体水稻的（黄华占-4x×华多8号）F1和（华多1号×华多8号）F1两个组合中，发现其中差异表达的21个NBS-LRR基因和71个转录因子（TF）与超级杂交水稻LYP9（两优培九）的不同。与LYP9的进行比较，其中57个QTL是不同的［44］，包括4个与结实有关（AQGH011、AQGH028、AQCB017和 AQED063）、15个 与 生 物产量有关、14个与穗数有关、24个与穗粒数有关的QTL。有趣的是，比较4个不同新型四倍体水稻的杂种F1，发现其中48个差异基因位于产量相关QTL区间，包括2个与千粒重相关（AQAI071和CQB16）、3个与结实相关（AQGH011、AQGH028和 CQB14）、13个与穗数相关的 QTL（AQCY027、AQGM014、CQK1、CQK2、CQK18、CQK19、CQAS135、CQJ1、CQJ2、CQJ4、CQJ9、AQFF055和AQFF061）；此外，新型四倍体水稻杂种优势的产生还可能涉及“非加性表达的基因”（nonadditiveexpressed genes）的表达［44］。

上述研究结果说明，新型四倍体水稻杂种优势的分子遗传机理较为复杂，与二倍体水稻具有相似之处，如杂种优势相关的显性基因聚集等；但也存在不同之处，如检测到特异的抗性、转录因子和QTL等。

4 挑战与展望

中国水稻杂种优势利用研究在世界上处于领先地位，为世界特别是我国粮食安全做出了巨大贡献。但应该指出，二倍体水稻育种也面临巨大的挑战，这主要是因为全球面临两大问题：一是人口不断增加带来的粮食安全问题。据预测，到2050年全球粮食需求比现在将增加50%［4］。所以，包括水稻在内的主要粮食作物的单产亟待提高；二是全球气候变暖、极端温度、干旱和洪涝频发、土壤退化、病虫害爆发等因素严重威胁作物生长和收获。为此，需要培育抗性更强的作物。现有二倍体水稻基因组较小，基因组缓冲能力有限，能否适应未来可能出现的剧烈环境变化还难以预测。为了应对以上问题，科学家提出了两条解决途径：一是栽培稻的多倍化，培育四倍体水稻，利用四倍体水稻的高抗性和强杂种优势；二是利用分子生物学技术加速异源四倍体野生稻的驯化，创制水稻新物种［4］。

新型四倍体水稻作为目前高育性的多倍体水稻之一，其杂种具有明显的优势，而且可以保持多代，有望在多倍体水稻育种上取得重大突破。为了在生产上利用新型四倍体水稻的杂种优势，需要加快解决以下3个瓶颈：

（1）创制高效不育系。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除新型四倍体水稻的TMS5基因，高效选育四倍体水稻温敏不育系。

（2）培育强恢复系。由于已报道发现了一系列与四倍体水稻杂种优势相关的基因，因此可利用水稻的海量重测序数据进行全基因组筛选，选出具有杂种优势相关基因优异等位型的水稻品种（系），直接加倍获得强恢复系与新型四倍体水稻不育系杂交，有望组配强优组合。

（3）解决四倍体水稻种子的成本问题。二倍体水稻只能利用杂种F1的优势而无法利用F2及其后代的优势，所以需要年年制种，制种成本较高。而四倍体水稻每个基因组包含4条染色体，每个位点有4个等位基因。从理论上讲，其杂合状态可以持续多代，而且不同座位的杂合状态可以保持更多世代。这为四倍体水稻的多代杂种优势利用提供了理论基础。有研究已初步证实四倍体水稻杂种自交后代的优势至少可以保持5代，即一次制种可以利用5代，使制种成本显著降低。

目前，本团队已初步解决以上3个难题，有望在不远的将来取得突破，实现新型四倍体水稻的成功利用，为促进水稻多倍体育种迈上新台阶作出贡献。

致谢：谨以此文纪念卢永根院士在稻种资源保护与创新研究上的杰出贡献。同时感谢本室其他成员及国内同行专家多年来的大力支持。由于我国有关同源四倍体水稻研究文献很多，所以，本文只列上部分文献，特此说明。