无瓣海桑叶斑病及其病原菌的生物学特性研究*

黄 华 冯金艳 陆建康 张良军刘幸儿 田龙艳

（1. 肇庆市封开县林业局森林病虫害防治检疫站，广东 肇庆 526500；2.广东省森林培育与保护利用重点实验室/广东省林业科学研究院，广东 广州 510520）

拟盘多毛孢属Pestalotiopsis由Steyaert 命名，他将广义盘多毛孢属中分生孢子具5 个细胞、中间具有3 个深色细胞的种归入Pestalotiopsis属[1]。按照最新的分类系统拟盘多毛孢属属于子囊菌门，盘菌亚门，粪壳菌纲，炭角菌亚纲，黑盘孢目，被毛孢科[2]。这类真菌在热带和亚热带地区分布最为广泛，寄主专一性不高，适应能力强，可引起多种植物病害，是一类重要的植物病原菌[3-4]。

无瓣海桑Sonneratia apetala属于桃金娘目海桑科海桑属的红树树种[5]。天然分布于孟加拉国、印度等国家。由于无瓣海桑具有生长快、适应性强、能改善滩涂立地条件、加快滩涂绿化等特点，1985 年被首次引种到我国海南岛，在20 世纪90年代又从海南引种到广东、广西、福建等地[6]。目前已成为我国华南沿海生态保护与恢复中最重要的红树树种[7-8]。

无瓣海桑在我国虫害危害较为严重[9-10]，病害危害较轻，有关无瓣海桑病害的研究尚鲜有报道[11]。前期研究发现无瓣海桑病叶组织分离到菌株WBHS-YB-2A，为拟盘多毛孢属新种Pestalotiopsis sonneratiae（未发表数据）。为了进一步确定无瓣海桑叶斑病的病原菌，本研究采用柯赫氏法则测定WBHS-YB-2A 的致病性、进行形态学观察和生物学特性等研究，以期明确无瓣海桑叶斑病及其病原菌的生物学特性，为无瓣海桑叶斑病的识别及防治提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

Pestalotiopsis sonneratiae： 菌 株WBHS-YB-2A，保藏于中国林业科学研究院，保藏号CFCC 57390。PDA 培养基：去皮土豆200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，琼脂粉15 g·L-1，pH 调至7.0。察氏培养基：KH2PO42.0 g·L-1，MgSO41.0 g·L-1，KNO32.0 g·L-1，葡萄糖20.0 g·L-1，琼脂20.0 g·L-1，pH 调至7.0。

1.2 试验方法

在PDA 平板上活化菌株WBHS-YB-2A，转接后培养5 d，备用。取新鲜健康的叶片清洗2次，用70%的酒精进行表面消毒，无菌水清洗2次，晾干后置于铺有润湿滤纸的培养皿中，备用。在菌株WBHS-YB-2A 菌落边缘用打孔器取直径5 mm 菌饼，接种于叶片上，以空白PDA 培养基作对照，设置8 个重复。放置于光照培养箱中培养（25 ℃，12 h 光照培养；22 ℃，12 h 暗培养），每日观察发病情况，记录病斑大小与发病率。采用离体接种方法进行致性测定[12-13]。

1.3 形态学特征

将活化的菌株WBHS-YB-2A 接种于直径9 cm的PDA 平板上，(25±1)℃恒温培养10 d。每隔2 d 观察菌落培养形态，待产孢后，挑取分生孢子于显微镜下观察形态特征。

1.4 生物学特性分析

1.4.1 碳源试验 以察氏培养基为基础培养基，其中碳源葡萄糖以可溶性淀粉、玉米粉、麦芽糖、蔗糖、果糖等量替换，配制成含糖量相同碳源不同的培养基[14-15]，灭菌后倒平板，接入5 mm 菌饼，以基础培养基为对照，每个处理3 个重复。置于(25±1)℃恒温培养箱中，每2 d 观察产孢、菌丝致密度等情况，同时测量菌落直径，记录生长速率。

1.4.2 氮源试验 以察氏培养基为基础培养基，其中的氮源KNO3以酵母浸粉、谷氨酸、尿素、蛋白胨等量替换，配制成含氮量相同氮源不同的培养基。接种、培养与数据统计与碳源试验处理一致。

1.4.3 温度试验 以PDA 培养基为基础培养基，将5 mm 菌饼接种到PDA 平板培养基中央，分别放入10、15、20、25、30 ℃的培养箱中培养，接种、培养与数据统计与碳源试验处理一致。

1.4.4 pH 试验 以PDA 培养基为基础培养基，用0.1 mol·L-1NaOH 和0.1 mol·L-1HCl，将培养基pH 分别调为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。按碳源试验的方法进行培养基的配制、接种、观察与测量。

1.5 数据分析

利用软件Microsoft Office Excel 2010 和SPSS 25.0 进行Duncan 氏新复极差差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 致病性

由图1 可知，接种3 d 后，无瓣海桑新鲜健康的叶片出现褐色点状病斑；6 d 后，表现为黑褐色圆形病斑；10 d 后病斑中心产生黑色的分生孢子堆，病斑可扩散至整个叶片。对照和老叶均未发病，接种感病症状与田间症状相似。对接种后发病的叶片进行分离，获得的菌株菌落形态、孢子形态、以及ITS 序列与菌株WBHS-YB-2A 一致。结果表明，菌株WBHS-YB-2A 对无瓣海桑有致病性，确定P. sonneratiae为无瓣海桑叶斑病的病原菌。

图1 室内离体接种症状Fig.1 Symptom of inoculation in vitro

2.2 无瓣海桑叶斑病危害症状

由P. sonneratiae引起的无瓣海桑叶斑病，在老叶和幼嫩的叶片均可发生，发病初期表现为褐色小点，病斑边缘有黄色的晕圈；随着病菌扩展，病斑逐渐扩大呈圆形或椭圆形或不规则，病斑外缘有黄色的晕圈，病斑外圈呈黑褐色，中心坏死褪色呈浅咖色，叶片不脱落。

2.3 无瓣海桑叶斑病菌形态特征

在PDA 上，无瓣海桑叶斑病菌菌落平展近圆形，产生白色絮状气生菌丝，菌丝发达致密，同时产生大量的分生孢子堆，呈墨色浓稠粘液，菌落同时伴有产生浅黄色至褐色沉淀（图2 A 和C）。在察氏培养基上，菌落不规则，菌落形态类似花瓣，菌丝较致密，菌落伴有产生浅棕色沉淀，未形成分生孢子堆（图2B）。分生孢子梗透明，光滑，柱状至壶状，环生。分生孢子梗不明显，常退化（图2D）。分生孢子纺锤形，直或稍弯曲，有4 隔膜，中间细胞3 个，棕色；顶端中间处附属物单2～3（图2E）。

图2 菌株培养形态Fig.2 Morphology of the cultured strain

2.4 无瓣海桑叶斑病菌的生物特性

2.4.1 不同碳源对无瓣海桑叶斑病菌的影响 由表1 可知，在不同碳源条件下，无瓣海桑叶斑病菌均可生长。在不同碳源培养基上菌丝生长速率依次为：葡萄糖＞麦芽糖=蔗糖＞淀粉＞玉米粉＞果糖，前四者和后两者之间差异显著，不同碳源培养基上均产生黄色色素，菌丝均较致密，无明显差异；在缺碳培养基上菌丝稀疏，生长速度最慢。由此可知该病原菌的最佳碳源为葡萄糖。

表1 不同碳源对菌株WBHS-YB-2A 的影响Table 1 Effects of different carbon sources on strain WBHS-YB-2A

2.4.2 不同氮源对无瓣海桑叶斑病菌的影响 由表2 可知，不同氮源培养基上菌株WBHS-YB-2A均可生长，但菌落形态、菌丝致密度差异较大，生长速率显著不同。其生长速率依次为：蛋白胨＞酵母膏＞谷氨酸＞KNO3＞尿素；以蛋白胨为氮源时，菌丝较致密，生长速度最快可达1.21 cm·d-1；以尿素为氮源时，菌丝致密，但生长最缓慢，生长速度仅为0.75 cm·d-1。

表2 不同氮源对菌株WBHS-YB-2A 的影响Table 2 Effects of different nitrogen sources on strain WBHS-YB-2A

2.4.3 不同温度对无瓣海桑叶斑病菌的影响 由表3 可知，不同温度对菌株菌株WBHS-YB-2A生长影响极显著（P＜0.01）。菌丝生长速率依次为：25 ℃＞20 ℃＞30 ℃＞15 ℃＞10 ℃。当温度≥30 ℃或≤15 ℃时，菌丝生长速率显著下降，其最适宜生长温度为20～30 ℃。

表3 不同温度对菌株WBHS-YB-2A 的影响Table 3 Effect of different temperature on strain WBHS-YB-2A

2.4.4 不同pH 对无瓣海桑叶斑病菌的影响 由表4 可知，菌株WBHS-YB-2A 在不同pH 培养基上生长速率依次为6.0＞5.0＞7.0=4.0＞8.0。该菌偏好于酸性的生长环境。

表4 不同pH 对供试菌株WBHS-YB-2A 的影响Table 4 Effect of different pH on strain WBHS-YB-2A

3 讨论与结论

拟盘多毛孢属的很多成员是重要的植物病原菌，能够造成农林作物减产和严重的经济损失。有报道表明，该类病原菌可在草莓、葡萄、苹果、红毛丹树、茶、莲雾等多种植物上引起病害.其中，叶斑病是其危害中最为常见的病害类型[16]。一般情况下，拟盘多毛孢的寄主专化性较弱，很多病原菌具有广泛的寄主[17]。在前期研究中，我们从无瓣海桑叶片和枝干病组织分离到的4 株拟盘多毛孢属菌株，形态学观察无明显差异，基于多片段构建的系统发育树分析，确定菌株WBHSYB-2A 为拟盘多毛孢属新种P. sonneratiae（未发表数据）。本文系统研究了P. sonneratiae菌株的致病性与生物学特性，发现叶片中分离得到的菌株WBHS-YB-2A 对新鲜幼嫩叶片具有较强的致病性，确定为无瓣海桑叶斑病的病原菌。同时，从无瓣海桑枝干上分离的P. sonneratiae菌株对叶片也具有致病性。但是，P. sonneratiae对无瓣海桑枝干是否具有致病性仍待进一步研究。

本研究针对无瓣海桑叶斑病菌的生物学特性进行了分析，明确了该菌对不同的碳源、氮源的利用情况，确定该菌最适碳源为葡萄糖、最适氮源为蛋白胨，在10～30 ℃均能生长，较适宜偏酸性环境条件，说明无瓣海桑叶斑病菌具有较强的适应能力，这与引起莲雾软腐病的异色拟盘多毛孢P.versicolor类似[18]。目前，国内外有关无瓣海桑叶斑病以及病原菌的报道较少，有关该类病害的致病机制、发生流行规律及其防治技术等尚不清楚，亟待开展相关研究。