伊春林下参皂苷超高压提取技术优化

王丹丽，邢振楠，刘艳杰，马珂，刘邦

(黑龙江省林业科学院伊春分院，黑龙江伊春153000)

人参(PanaxginsengC．A．Meyer)为伞形目五加科人参属多年生草本植物[1]，是一种名贵的中药材，它通体具有较高药性，最主要的成分是人参皂苷，功效强，常被用于研发生产抗癌症、改善心律失常、缓解心肌缺血等方面的药物。目前，研究者们常用的提取方法有煎煮法、浸渍法[2]、回流法、索氏提取法、水解法、泡沫分离法、微波辅助萃取法、超声辅助提取法、生物提取法等,利用上述技术方法提取皂苷，存在耗时长、提取率不高、不节约能源等缺点[3]。采用超高压提取林下参皂苷是一种新兴有效的提取手段[4]，利用流体静压骤减作用于目标物细胞璧，使其膜透化，快速提取目标成份，此方法一般较多用来提取中草药中热不稳定成份，因为它不会受到温度的制约，而且操作反应时间短[5]。试验进行伊春林下参皂苷的提取，采用超高压技术，并合理设计优化林下参皂苷的提取工艺[6]。工艺具有可操作性高、用时短，节能环保、绿色无污染等明显优势。

1 仪器与材料

超高压等静压机，电子天平，旋转蒸发器，紫外可见分光光度计，超声波发生器，恒温水浴祸，离心机。林下参(产于小兴安岭伊春)，人参皂苷对照品Re，实验过程中所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 人参皂苷的测定

标准曲线的制备：精确称取人参皂苷Re对照品6.2 mg，取25 mL容量瓶加甲醇定容标准液，精确量取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于具塞试管中，待溶剂挥干后，继续每支试管里量取加入5%香草醛-冰醋酸0.2 mL 、HClO40.8 mL，将试管放于于恒温水浴锅中，设定温度60 ℃定时15 min，加入CH3COOH5mL，冷却[7]。紫外分光光度计设置波长在350～850 nm进行扫描，测定550 nm为最大吸收波长，在此处测A值，得人参皂苷Re质量浓度y (mg/mL)与吸光度值A的回归方程：Y=0.033A该方程的相关系数r=0.9994[6]。

2.2 样品处理

林下参干根样品干燥，破碎机粉碎后过0.425 mm筛，按每40 mL加入1 g干粉的比例加入CHCl3，回流3 h后进行脱脂把溶剂回收，剩下的样品残渣挥干溶剂后备用。

2.3 人参皂苷提取

精确称取林下参干粉末0.5 g，按实验设计加入溶剂后封口摇匀，在经过高压处理后，用离心机4000 r/min离心后取上清液，测量吸光度(A)值。

样品测定：精确量取处理好的样品0.2 mL,测吸光值A，并计算林下参皂苷提取收率Y(%)。

Y(%)=0.0198×A×(V/V1)×(1/m) ×100

其中：A为吸光度值，V为提取液总体积，V1为检测时所取溶液体积，m为人参样品质量。

2.4 单因素试验及结果

2.4.1 溶剂的选择。称取4份处理后的样品，每份0.5 g，分别加入25 mL的水、水饱和CH3(CH2)3OH、CH3OH、50%CH3CH2OH后封口摇匀，调整压力为500 MPa，保压2 min，用离心机4000 r/min离心后取上清液，测量吸光度(A)值，结果见(表1)。

表1 超高压提取林下参皂苷的不同溶剂选择

为了高速、高效提取林下参皂苷，选好一种适合的溶剂很重要，这样可以减少杂质含量，目前常用的提取溶剂有水、正丁醇、甲醇、乙醇等，它们对人参皂苷的溶出率各不相同，所采取的工艺条件也存在一定差异。由于乙醇提取率高、无毒害、方便回收等突出优点，所以选择乙醇作为超高压提取林下参皂苷的溶剂。

2.4.2 溶剂体积分数的选择。首先用50%的乙醇配置出体积分数为10%、20%、30%、70%、90%的溶剂，称取5份处理后的样品，每份0.5 g，分别加入25 mL的不同体积分数的溶剂，封口摇匀，调整压力为500 MPa，保压2 min，取上清液离心测定A值，结果见(表2)。

表2 超高压提取林下参皂苷的乙醇体积分数的选择

在乙醇溶剂体积分数在10%～70%之间时，溶剂体积分数大小与人参皂苷的提取得率成正比。而当溶剂体积分数为90%时，人参皂苷的提取收率有了明显的降低。

2.4.3 固液比的选择。用70%乙醇按固液比1∶10、1∶25、1∶50、1∶75、1∶100分别配置溶液，称取5份处理后的样品，每份0.5 g，分别加入,封口摇匀，在经过500 MPa高压、保压2 min处理后，用离心机4000 r/min离心后取上清液，测量吸光度(A)值，结果见(表3)。

由表3分析，随着固液比的变化，林下参皂苷的提取率也在发生变化它的得率是逐渐稳步提高的。从实验角度出发，将固液比范围选定为为1∶25～1∶75之间，能够更好的提取有效成分，经济性也更合理。

表3 超高压提取林下参皂苷的不同固液比的选择

2.4.4 压力的选择。称取5份处理后的样品，每份0.5 g，分别抽取25 mL固液比为1∶100的70%乙醇，封口后摇匀，分别在压力100、200、300、400、500、600 MPa的压力处理下，保压2 min、离心机4000 r/min离心取上清液，测定A值，结果见(表4)。

表4 超高压提取林下参皂苷的不同压力得率比较选择

压力对超高压提取林下参皂苷的影响因子很大，从表4可见，压力在100～500 MPa之间时，提取压力与提取率呈线性正相关关系，当压力超过600 MPa时，提取收率缓慢降低。所以，确定最佳压力范围100～500 MPa之间。

2.4.5 提取时间的选择。在林下参皂苷超高压提取的时间中，所需提取时间也是一个重要因子。在实验条件一致下，实验结果见(图1)。

图1 不同提取时间对提取收率的影响

通过图1可以看出，林下参皂苷的提取率和提取时间的长短之间并无明显正相关线性关系，出现这种现象的原因是提取过程中压力较高，外部溶剂能够迅速透过细胞壁进入到细胞里。

2.5 单因素试验及结果

试验参照陈瑞战等[5]的实验进行了单因素的实验，结果表明，得到了超高压提取林下参皂苷的合适溶剂为乙醇、溶剂浓度范围、提取压力范围100～500 MPa、固液比1∶25～1∶75、保压时间1～2 min。

2.6 正交试验结果分析

在单因素实验数据的基础上，设计L9(34)正交实验(见表5、表6)。

表5 因素水平表

表6 L9(34)正交试验设计方案及结果

由表6可以得出，3种因素对人参皂苷提取率的影响依次为A>B>C，即提取压力对人参皂苷提取率有极显著影响，而溶剂体积分数和固液比对人参皂苷提取率的影响不明显。结果表明，三种因素的优化组合为 A3B2C3，即伊春林下参皂苷超高提取技术工艺及条件为提取压力500 MPa、溶剂体积分数为50%、固液比1∶75、提取时间2 min，在优化条件下，提取林下参皂苷收率最高。经进一步试验验证，按优化条件提取人参皂苷，测得提取率高达7.61%。

3 结论

在常温下使用超高压提取林下参皂苷是一个新兴的提取工艺，能够很好的减少高热对皂苷结构的影响。通过优化试验，在提取压力达到500 MPa、料液比在1∶75的比例下、溶剂为浓度50%的乙醇时，林下参皂苷的提取得率最高可达到7.61%，林下参皂苷技术优化也为森林食品天然产物有效成分的提取开拓了一种新的工艺。它打破了很多传统提取手段的瓶颈，具有很多突出的优点，因为在采用超高压提取皂苷的整个过程中是封闭的，没有溶剂挥发，能耗低、所以绿色环保，该方法用时短，简易环保、适合用于人参皂苷的工业化生产，可为目前其他热门森林食品的天然产物活性成分提取提供参考。