HPLC法测定南方红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ和金松双黄酮含量*

凌子懿，吴泽君，包 敏，唐小鹏，肖人钟，丁 野

(1 株洲市食品药品检验所，湖南 株洲 412000；2 湖南天大生物科技股份有限公司，湖南 长沙 410136；3 湖南省药品检验研究院，湖南 长沙 410136)

红豆杉始见于《本草纲目》，记载其可以治疗霍乱、伤寒，在我国药用历史悠久。南方红豆杉来源为红豆杉科植物南方红豆杉Taxuschinensis(Pilger.)Rehd. var.mairei(Lemee et Levl.)Cheng et L.K.Fu的带叶枝条，其药材或饮片为广东、湖北、浙江、上海、安徽等省市中药材标准或中药饮片炮制规范所收载，药用部位均为带叶干燥枝条，功效为消肿散结、通经利尿，用于治疗肿瘤、糖尿病、肾病、类风湿关节炎、水肿、风湿痹病等症。现代研究表明，紫杉醇、10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ等紫杉烷类成分具有抗癌活性[1-2]，金松双黄酮、银杏双黄酮等黄酮类成分具有抗肿瘤、降脂、抗血栓、抗氧化、抗炎、抗骨质疏松病等多种药理作用[3-6]，为南方红豆杉主要活性成分。《湖北省中药材质量标准》2018年版、《上海市中药饮片炮制规范》2018年版等现行南方红豆杉药材和饮片质量标准仅收载了10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量测定项目，无黄酮类成分质量控制指标。本实验采用高效液相色谱法同时测定南方红豆杉药材中紫杉烷类主成分10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ、黄酮类主成分金松双黄酮的含量，并对湖南、江西、福建等不同产地、不同品种的南方红豆杉含量进行考察，为南方红豆杉药材及饮片的质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药

仪器：美国Waters-E2695型高效液相色谱仪、Empower色谱工作站，美国沃特世公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；XSE205DU电子分析天平，梅特勒托利多有限公司。

药材：南方红豆杉药材共16批，其中普通品种样品10批，药用型优树品种样品6批。经株洲市食品药品检验所吴泽君主任药师鉴定为红豆杉科植物南方红豆杉Taxuschinensis(Pilger.)Rehd. var.mairei(Lemee et Levl.)Cheng et L.K.Fu的带叶枝条。

试剂：10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(批号：PRF20031626，含量：98%)成都普瑞法科技开发有限公司；金松双黄酮(批号： PRF9110541；含量：98%)成都普瑞法科技开发有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯；实验用水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱，以甲醇为流动相A，乙腈为流动相B，0.1%冰醋酸为流动相C，进行梯度洗脱，见表1；流速：1.0 mL/min；检测波长：232 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

2.2 对照品溶液的制备

取10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ、金松双黄酮对照品各适量，精密称定，加甲醇溶解，配制成单一对照品贮存液，精密量取单一对照品贮存液适量，加无水乙醇制成10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ浓度为216.0 μg·mL-1、金松双黄酮浓度为200.9 μg·mL-1混合对照品储备液，备用。

2.3 供试品溶液及空白溶液的制备

取药材粉末(过四号筛)0.2 g，精密称定，置锥形瓶，加入无水乙醇25 mL，超声45 min，放冷，再称定重量，加无水乙醇补足重量，过滤，取续滤液即得供试品溶液。不加供试品，同法操作，即得空白溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察

精密吸收对照品储备液适量，用无水乙醇稀释制成10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ浓度为0.8640、2.160、4.320、10.80、21.60、43.20、216.0 μg·mL-1，金松双黄酮浓度为0.8036、2.009、4.018、10.04、20.09、40.18、200.9 μg·mL-1系列溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以浓度(X)为横坐标，对照品溶液峰面积(Y)纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ、金松双黄酮回归方程分别为Y=7871.5X-3649.7， r=0.9999，Y=1523.6X+7755.3， r=0.9997，线性范围分别为0.8640～216.0 μg·mL-1，0.8036～200.9 μg·mL-1。结果表明2种成分在相应浓度范围内线性关系良好。

2.4.2 检出限及定量限

取2.2项下对照品溶液逐级稀释，按2.1项下色谱条件测定，以信噪比(S/N)为3所对应的浓度为检测限，信噪比(S/N)为10所对应的浓度为定量限。10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ检出限为0.14 μg·mL-1，定量限为0.43 μg·mL-1，金松双黄酮的检出限为0.20 μg·mL-1，定量限为0.67 μg·mL-1。

2.4.3 精密度考察

取同一混合对照品溶液，连续进样6次，按照2.1项下色谱条件测定，结果是10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ、金松双黄酮峰面积的RSD分别为0.36%，0.61%，表明仪器精密度良好(n=6)。

2.4.4 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0，2，4，6，12，24 h按2.1项下色谱条件测定，结果是10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ、金松双黄酮的面积的RSD分别为0.75%，0.58%。表明供试品在24 h内稳定(n=6)。

2.4.5 重复性试验

取同一南方红豆杉样品6份，按照2.3项下操作，制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，结果是10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ、金松双黄酮的质量分数的RSD分别为0.79%、0.72%，表明方法重复性良好(n=6)。

2.4.6 加样回收率

取已知含量南方红豆杉样品0.1 g，精密称定，共6份，分别加入一定量10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ、金松双黄酮对照品溶液，按2.3项下制备成供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表2。表明方法准确性良好。

表2 回收率试验(n=6)Table 2 Recovery rate test(n=6)

2.5 样品测定

取16批样品，按照2.3项下操作，制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，计算含量，结果见图1和表3。

1.10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ；2.金松双黄酮图1 溶剂空白(A)、混合对照品(B)和 南方红豆杉药材样品(C)HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms of solvent blank(A)， mixed reference substances(B)and sample of Taxuschinensis var. mairei ramulus et folium(C)

表3 南方红豆杉含量测定结果Table 3 Determination results of contents in Taxus chinensis var. mairei

3 讨 论

3.1 提取方法的优化

本实验考察了甲醇、无水乙醇、甲醇∶丙酮(3∶1)3种提取溶剂，超声提取(30、45、60 min)、回流提取(1.0、1.5、2.0 h)2种提取方法。结合样品中2种待测成分的提取率及提取效率，确定样品提取方法为超声提取，提取溶液为无水乙醇，提取时间为45 min。

3.2 检测波长及流动相选择

本实验采用二极管阵列检测器对2种待测成分在200～ 400 nm波长范围扫描，考察待测成分的紫外吸收光谱。结果10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ在227 nm、232 nm波长处有较强吸收峰，金松双黄酮在232 nm、330 nm波长处较强吸收峰。综合考虑溶剂的截止使用波长、样品中杂质的干扰以及2种成分的吸收强度，确定232 nm作为检测波长。10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ为紫杉烷类生物碱，金松双黄酮为黄酮类双黄酮成分，2种成分极性差异很大。本实验以甲醇、乙腈、水、0.1%冰醋酸4种溶剂作为流动相组分，进行不同组合的等度或梯度洗脱考察。结果以本实验采用的甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸作为流动相，梯度洗脱， 2种成分与邻峰分离度好，分析周期最短。

3.3 不同产地及南方红豆杉样品中成分含量的差异

本实验对不同产地、品种南方红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ、金松双黄酮的含量进行了测定研究，结果显示普通品种中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量明显低于药用型优树品种，金松双黄酮含量差异不大；不同产地相同品种的南方红豆杉样品中2种成分含量无明显差异。故宜选用药用型优树品种作用南方红豆杉药材和饮片的植物来源。

4 结 论

综上所述，本方法操作简单，精密度、稳定性、重复性好，可用于南方红豆杉药材及中药饮片的质量控制。