外源壳寡糖对低温胁迫条件下烟草幼苗的保护作用

陈芊如， 丁蓬勃， 胡希好， 赵福彬， 邰振益， 赵忠利， 刘宗霞， 李义强， 邹 平

(1.中国农业科学院烟草研究所，山东青岛 266000； 2.山东青岛烟草有限公司，山东青岛 266000)

烟草是一种喜温植物，其最适生长温度范围是25～28 ℃，当温度下降至12 ℃以下时，烟草出苗率下降，苗期生长缓慢。低温胁迫下，烟草幼苗体内产生大量活性氧(ROS)，生理代谢发生紊乱，叶片光合速率下降，能量产生和物质代谢受阻，最终导致植株叶片萎蔫甚至死亡。在福建省、江西省等南方烟区，在早春常有倒春寒等低温危害发生；在西南、黄淮、东北烟区，苗床期低温寡照的情况也时常发生，导致移栽后烟苗质量差，还苗期延长，烟叶的产量和质量受到影响。因此，如何缓解低温胁迫对烟草植株尤其是烟草幼苗的伤害是烟草生产中亟待解决的问题。

几丁质(别称甲壳素)是一种天然聚合物，在地球上含量非常丰富，几丁质脱乙酰基后降解产生壳寡糖(COS)。壳寡糖是一种水溶性的碱性寡糖，也是一种海洋来源生物刺激素，能够促进植物生长，增强植物的抗病性和抗逆性。研究表明，壳寡糖能够通过增强植株光合作用及抗氧化酶活性提高油菜、甘蔗、玉米、花生等作物的抗旱性。笔者所在实验室前期研究发现，壳寡糖能够通过调节离子转运及渗透调节提高小麦幼苗的抗盐性；还能够增强小麦光合作用及抗氧化能力，从而提高小麦低温抗性。在烟草上，相关文献报道，壳寡糖能够诱导烟草对烟草花叶病毒(TMV)的侵染产生系统抗性；对烟草赤星病病原菌菌丝生长、孢子萌发、产孢量均有一定的抑制作用；但对壳寡糖能否提高烟草抗低温胁迫的研究还未见报道。针对烟草幼苗易受冷害影响的生产实际问题，本试验选用低温敏感的烟草品种为材料，研究低温胁迫下壳寡糖对烟草幼苗生理指标的影响，以期为烟草苗期栽培管理提供理论和技术依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烟草资源为H382，属于低温敏感材料，由中国农业科学院烟草研究所国家烟草种质资源中期库提供。壳寡糖(脱乙酰度>95%，聚合度3～10)购自肇庆市生物科技有限公司。试验于中国农业科学院烟草研究所人工气候箱中进行，试验时间为2020年10—12月。

1.2 试验方法与测定指标

1.2.1 培养方法 用1%次氯酸钠溶液将H382种子消毒10 min，再用蒸馏水反复冲洗后晾干，点种至育苗盘。待烟草幼苗长到4叶期时，将长势一致的烟苗移栽到直径为10 cm的塑料盆中，放入光照时间为14 h、昼/夜温度为25 ℃/20 ℃、光照度为 800 μm/(m·s)、相对湿度为(65±5)%的人工气候培养箱中。

待烟草幼苗长出第6张叶片时，将其随机分为3组(每组20盆)。对照组(CK)于人工气候培养箱25 ℃培养；低温胁迫组于人工气候培养箱4 ℃培养，并分别喷施0(Chilling stress)、50(T1)、100(T2)、500 mg/L(T3)壳寡糖，24 h后移到4 ℃人工气候培养箱培养。在低温胁迫后24、48、72 h取叶片，迅速放入液氮中速冻，并置于-80 ℃超低温冰箱中保存，用以测定各项生理指标，每个处理3次重复。在低温胁迫7 d后，进行样品采集测定其生物量。

1.3 统计方法

采用 SPSS(version 19.0)软件中的Duncan’s多重比较分析法，对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 壳寡糖对低温胁迫下烟草幼苗活性氧(ROS)含量的影响

2.2 壳寡糖对低温胁迫下烟草幼苗MDA和脯氨酸含量的影响

从图2可以看出，低温胁迫下，烟草幼苗体内MDA含量呈现逐渐上升的趋势，在胁迫24、48、72 h时，MDA含量分别比对照组高47.3%、62.9%、67.4%。壳寡糖处理能够显著降低烟草叶片中MDA含量，其中，100 mg/L壳寡糖效果最好，其处理组MDA含量显著降低，与对照组没有显著性差异。在处理24、48、72 h时，T2处理组MDA含量分别比低温胁迫组低26.6%、34.4%、37.6%(图2-A)。随着低温处理时间的不断延长，烟草幼苗中脯氨酸含量呈现先升高后降低的趋势。在胁迫24、48 h 时，脯氨酸含量分别是对照组的1.37、1.85倍；胁迫72 h时脯氨酸含量有所下降，但仍然是对照组的1.48倍。在低温胁迫下，施用不同浓度壳寡糖能够显著增加烟草叶片脯氨酸含量。其中，100 mg/L 壳寡糖处理组脯氨酸含量显著高于其他浓度处理组，在处理24、48、72 h时，脯氨酸含量分别比低温胁迫组高37.2%、19.6%、40.1%(图2-B)。

2.3 壳寡糖对低温胁迫下烟草叶片渗透调节物质的影响

从图3可以看出，低温胁迫24、48、72 h后，烟草幼苗叶片可溶性糖含量先升高后降低。在24、48 h 时，烟草叶片可溶性糖含量比对照组分别升高12.9%、12.7%；胁迫72 h后，烟草叶片可溶性糖含量比对照组略低，但与对照组之间无显著性差异。不同浓度壳寡糖处理后，烟草叶片可溶性糖含量显著升高；其中100 mg/L壳寡糖处理组在24、48、72 h时，可溶性糖含量比低温胁迫组分别高19.9%、28.1%、64.6%(图3-A)。在低温胁迫下，烟草幼苗体内可溶性蛋白含量也呈现先升高后降低的趋势；施用外源壳寡糖可以显著提高烟草叶片可溶性蛋白含量(图3-B)。

2.4 壳寡糖对低温胁迫下烟草叶片抗氧化酶活性的影响

低温胁迫下，烟草幼苗叶片中的SOD、POD、CAT及APX活性均呈现先上升后下降的趋势。在低温胁迫24、48 h时，SOD活性分别比对照组高30.3%、26.1%(图4-A)；POD活性分别比对照组高12.6%、26.3%(图4-B)；CAT活性分别比对照组高45.0%、53.1%(图5-A)；APX活性分别比对照组高24.5%、33.1%(图5-B)。在低温胁迫 72 h 后，SOD、POD、CAT及APX活性均有所下降。不同浓度壳寡糖处理能够继续提升SOD、POD、CAT及APX活性。在100 mg/L壳寡糖处理的24、48、72 h 时，SOD活性分别比低温胁迫组高48.0%、70.4%、124.3%(图4-A)；POD活性分别比低温胁迫组高36.0%、47.0%、92.2%(图4-B)；APX活性分别比低温胁迫组高13.9%、35.1%、51.6%(图5-A)；APX活性分别比低温胁迫组高59.6%、69.0%、79.6%(图5-B)。可见，施用外源壳寡糖可以显著提高烟草幼苗体内抗氧化酶活性，其中，100 mg/L壳寡糖处理组中烟草幼苗抗氧化酶活性最高。

2.5 壳寡糖对低温胁迫下烟草幼苗生物量的影响

对烟草幼苗继续进行培养及低温胁迫，在培养7 d时，处理组间烟苗表型差异明显，低温胁迫下，烟草幼苗长势缓慢，植株矮小，叶片出现萎蔫。与对照组相比，烟草幼苗根长减少41.0%，地上部分和根系的鲜质量、干质量分别减少22.5%、24.9%和45.4%、49.1%(表1)。喷施不同浓度壳寡糖溶液能够缓解低温胁迫对烟草幼苗的伤害，促进植株与根系生长。从表1可以看出，壳寡糖处理能够显著增加根长，显著提高烟草幼苗地上部分以及根系的鲜质量、干质量。其中，100 mg/L壳寡糖处理后，烟草幼苗根系的鲜质量和干质量与其他浓度壳寡糖处理组差异显著。

表1 低温胁迫下壳寡糖对烟草幼苗生物量的影响

3 讨论与结论

植物在逆境胁迫下细胞渗透势会发生改变。植物通过积累可溶性糖和可溶性蛋白等小分子物质，来降低细胞的水势，维持细胞内水分平衡和膜的稳定性，从而动态调节细胞渗透势；同时，糖类是细胞结构的重要组成部分，而且是能量和物质基础。周培禄通过转录组和代谢组分析发现，在低温胁迫下烟草氮代谢和糖代谢增强，提高了细胞内游离氨基酸和其他含氮物质甜菜碱的含量，增加了可溶性糖含量，从而调节了细胞渗透式，维持细胞水分平衡，提高了烟草抗寒性。本试验中低温胁迫24、48 h时，烟草幼苗体内渗透调节物质含量均明显增加；而在胁迫72 h时，含量则开始下降，这可能是因为低温抑制了植物体内酶活，造成渗透调节物质合成和代谢受阻。外源施用壳寡糖可以进一步显著提高烟草幼苗渗透调节物质含量，有助于维持植物的渗透平衡和细胞膜稳定性。有研究表明，低温胁迫下，喷施壳寡糖可以增加小麦体内可溶性糖含量，减弱低温对植物组织液的冷滞效应，保证细胞中溶质的流动性。

在逆境胁迫下，脯氨酸发挥着多种生理学功能，游离脯氨酸具有强亲水性，能够降低细胞水势，缓解逆境胁迫造成的细胞脱水；脯氨酸还能够与蛋白质形成输水的骨架，保护结构的稳定性，维护植物体内细胞膜结构的完整。有研究表明，外源施用脯氨酸能够提高植物抗氧化酶活性，增强植株光合作用从而提高植物抗盐性。有趣的是，脯氨酸处理组植株中内源脯氨酸含量升高，可溶性糖含量降低，说明脯氨酸可能限制了盐胁迫植物对可溶性糖合成的需要，而由脯氨酸起重要的渗透保护作用。本试验中低温胁迫诱导产生的脯氨酸含量高于对照组，壳寡糖处理进一步提高了低温胁迫下烟草幼苗的脯氨酸含量，以缓解低温导致的渗透胁迫。外源施用褐藻寡糖、水杨酸、调环酸钙均可以提高低温胁迫下烟苗幼苗体内的脯氨酸含量，缓解低温造成的渗透胁迫，提高植物抵抗低温胁迫的能力。

综上所述，施用外源壳寡糖可以降低低温胁迫对烟草幼苗的氧化损伤，增加渗透调节物质含量，增强植株抗氧化活性，从而缓解烟草幼苗在低温环境下受到的伤害。低温胁迫下，壳寡糖对烟草幼苗的保护作用，为缓解烟草应对倒春寒等低温灾害提供了良好的思路。其中，100 mg/L壳寡糖对低温胁迫下烟草幼苗的缓解作用最强，高浓度壳寡糖缓解效果反而降低；因此，在实际生产应用中，考虑到效益及成本，100 mg/L壳寡糖是最优选择。为了更好地研究壳寡糖对烟草抗低温能力的影响，其低温缓解效应的分子机制、品种的响应差异还有待进一步研究阐明。