醒脾解郁方对抑郁大鼠结肠脂多糖、促炎细胞因子及紧密连接蛋白的影响

于姚 郭蓉娟 任非非 卢天戈 李俊男 朱晓晨

抑郁症是一种多病因异质性的精神类疾病，其发病机制尚不明确。十九世纪八十年代提出“单胺递质假说”[1]，目前临床中常用抗抑郁药仍多依赖该假说，但存在部分患者无效、副作用多等问题[2]，寻找新的治疗靶点与手段成为当务之急。近年来，肠道微生态成为现代医学研究的热点，大量证据表明抑郁症存在肠道微生态失衡，调节肠道微生态失衡及其介导的炎性反应可能成为抑郁症防治的新靶点。课题组通过多年临床观察及实验研究[3-4]，证实醒脾解郁方对抑郁症有明显改善作用。醒脾解郁方是本课题组在王永炎院士提出的抑郁症“醒脾解郁法”指导下创制的方药，全方由西洋参、石菖蒲、郁金、贯叶金丝桃4味药组成。“醒脾”取醒复脾之神机之意，“解郁”即疏郁理气。醒脾解郁方临床疗效显著，其有效率可达93.55%[3]，但其作用机制有待进一步研究。本实验采用慢性束缚应激的方法建立抑郁大鼠模型，观察醒脾解郁方对抑郁大鼠结肠脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、炎性反应及肠粘膜屏障的调节作用，以期揭示醒脾解郁方的效应机制，为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠30只，8周龄，体质量(200±20)g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2019-0010，饲养于北京市中医研究所动物房，室温20～26℃，相对湿度40%～70%，IVC设备饲养，昼夜明暗交替时间12/12小时，所有动物均采食灭菌饲料、饮用灭菌水。

1.2 药物和试剂

醒脾解郁方：西洋参30 g、石菖蒲30 g、郁金30 g、贯叶金丝桃30 g，采用配方颗粒，北京康仁堂药业有限公司提供。草酸艾司西酞普兰片：规格10 mg×10片/盒，四川科伦药业股份有限公司生产，国药准字H20080788。

结肠脂多糖试剂盒(货号DG11072H)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)[2]试剂盒(货号DG94490Q)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)[3]试剂盒(货号DG20065D)，均购于北京冬歌博业生物科技有限公司；蛋白提取液(货号MDL91201)、蛋白酶抑制剂(货号MD912893)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号MD913053)、聚丙烯酰胺凝胶电泳预制胶套装试剂盒(货号MD911919)，均来源于北京百奥思科生物医学技术有限公司[4]；中等蛋白分子量标记物(货号26617)，来源赛默飞世尔科技公司；ZO-1抗体(货号bs-1329R)，闭合蛋白(occludin)抗体(货号bs-10011R)，来源北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 分组与造模

30只大鼠经适应性饲养后随机分为空白对照组、模型组、中药组、西药组。空白对照组与模型组各7只，中药组、西药组各8只。

采用慢性束缚应激复制抑郁大鼠模型。将大鼠放置于特制的束缚筒中，束缚筒前端内放置无底圆嘴塑料瓶及金属网通气口，能够调节结合处改变活动空间，每天束缚3小时，连续应激21天后测定糖水偏好率及强迫游泳不动时间进行模型评价。空白对照组不予应激。

1.4 给药方法

造模同时灌胃给药，空白对照组及模型组以蒸馏水灌胃；中药组以醒脾解郁方灌胃，按临床等效剂量12.5 g/(kg·d)；西药组以草酸艾司西酞普兰灌胃，按临床等效剂量1 g/(kg·d)。均为每日1次，连续给药21天。

1.5 取材及检测

末次造模及干预后进行取材，腹腔注射7%水合氯醛麻醉后，沿腹中线剖开腹腔，分离肠组织，距离肛门2～10 cm处取结肠组织，用PBS溶液快速冲洗，液氮冻存备用。

取结肠组织匀浆，酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)结肠组织LPS、IL-6、TNF-α含量：按照试剂盒说明书进行实验，根据标准品光密度值(OD值)做标准曲线，根据各样品的OD值计算各样品浓度。

取大鼠结肠组织提取蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，测定样品在562 nm波长附近的OD值，绘制标准曲线，计算蛋白浓度。制备SDS-PAGE 凝胶，按80V 30分钟、120V 60分钟进行电泳。制作“三明治”板，放至电泳槽中65v 2小时进行转膜。取转移膜置于封闭液，室温下摇床封闭1小时。进行抗体孵育。1∶1混合ECL试剂盒中试剂，混合液均匀滴加在PVDF膜表面反应4分钟，最后放入化学发光成像系统成像。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 模型评价

2.1.1 宏观表征 造模前，各组大鼠精神良好，反应敏捷，灵活好动，毛发洁白顺滑，大便干湿适中。首次束缚造模时，各组大鼠均强烈反抗与嘶叫，毛发及胡须竖起，排便排尿明显增多，束缚结束后迅速逃脱，仍表现出较强应激反应，有洗脸、理毛等行为。持续造模过程中，各组大鼠的反抗程度逐渐减低，活动减少，嗜卧，毛发干涩，出现大便干湿不调。造模后期，模型组大鼠体质量增长明显缓慢，精神倦怠，喜扎堆或蜷缩，对束缚无明显抵抗，毛发干枯发黄。而此时中药组与西药组大鼠一般状况明显好于模型组，活动相对较多，束缚刺激仍有明显抵抗，毛发色白稍凌乱，大便基本正常。

2.1.2 体质量变化 基线时，各组大鼠体质量无明显差异(P>0.05)；实验过程中，各组大鼠体质量均呈上升趋势，造模3周末，模型组体质量明显低于空白对照组(P<0.05)，中药组与西药组体质量均明显高于模型组(P<0.05)，但仍低于正常组；中药组与西药组相比无明显差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体质量变化

2.1.3 糖水偏好实验 基线时，各组大鼠糖水偏好率无显著差异(P>0.05)；造模3周末，与空白对照组相比，模型组大鼠糖水偏好率明显下降(P<0.05)，与模型组相比，中药组及西药组糖水偏好率明显升高(P<0.05)，中药组与西药组相比无显著差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠糖水偏好率

2.1.4 强迫游泳实验 基线时，各组大鼠游泳不动时间无显著差异(P>0.05)；造模3周末，与空白对照组相比，模型组大鼠游泳不动时间明显延长(P<0.05)，与模型组相比，中药组及西药组游泳不动时间明显较少(P<0.05)，中药组与西药组相比无显著差异(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠强迫游泳不动时间

2.2 各组大鼠结肠组织LPS含量比较

与空白对照组相比，模型组结肠LPS水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，中药组、西药组结肠LPS水平均显著降低(P<0.05)；与西药组相比，中药组结肠LPS水平显著降低(P<0.05)，见表4。

表4 各组大鼠结肠LPS含量变化

2.3 各组大鼠结肠组织IL-6、TNF-α含量比较

与空白对照组相比，模型组结肠IL-6、TNF-α含量均明显升高(P<0.05)；与模型组相比，西药组结肠IL-6含量明显降低(P<0.05)，TNF-α含量有降低趋势，差异无统计学意义，中药组结肠IL-6、TNF-α含量均明显降低(P<0.05)；与西药组相比，中药组结肠IL-6、TNF-α含量均显著降低(P<0.05)，见表5。

表5 各组大鼠结肠IL-6、TNF-α含量变化

2.4 各组大鼠结肠组织ZO-1、Occludin蛋白浓度比较

与空白对照组相比，模型组ZO-1、Occludin蛋白表达均显著降低(P<0.05)；与模型组相比，西药组ZO-1蛋白表达有升高趋势，差异无统计学意义，Occludin蛋白表达升高，有显著差异(P<0.05)，中药组ZO-1、Occludin蛋白表达均显著升高(P<0.05)；与西药组相比，中药组ZO-1蛋白表达有升高趋势，差异无统计学意义，Occludin蛋白表达升高，有统计学意义(P<0.05)，见表6，图1。

表6 各组大鼠结肠ZO-1、Occludin蛋白表达变化

图1 各组大鼠结肠ZO-1、Occludin蛋白表达

3 讨论

慢性、长期、低强度的应激源是抑郁症发生发展的主要原因，慢性束缚作为一种常用的应激模型，通过限制大鼠自由活动压抑其天性，能模拟出抑郁症的快感缺乏核心症状，且可操作性强，重复性好，广泛用于抑郁症研究[5]。故本次实验采用慢性束缚法构建抑郁症模型，并在造模第3周末进行模型评价。通过宏观表征、体重增长及行为学测评证实本次实验造模成功。

在结肠炎症方面，本研究发现，相较于正常对照组，模型组大鼠结肠中LPS、IL-6、TNF-α含量均显著增加(P<0.05)，提示结肠中存在炎症反应。而醒脾解郁方可显著降低上述指标含量(P<0.05)，表明醒脾解郁方可通过抑制结肠炎症反应发挥作用。且与西药相比，醒脾解郁方LPS、IL-6、TNF-α含量更低，两组之间差异具有统计学意义(P<0.05)，提示中西药均能够不同程度的改善结肠炎症。

在肠粘膜屏障方面，本研究结果表明，模型组大鼠ZO-1、Occludin蛋白较正常对照组均显著下降(P<0.05)，提示抑郁大鼠存在肠粘膜屏障损伤，与Belgnaoui A等[6]的研究结果较为一致。而相较于模型组，醒脾解郁方可显著提高ZO-1蛋白表达(P<0.05)及Occludin蛋白表达(P<0.05)，西药组Occludin蛋白表达显著升高(P<0.05)，ZO-1蛋白表达有升高趋势，但无统计学意义。中西药之间相比，中药组Occludin蛋白表达较西药组升高(P<0.05)。ZO-1和Occludin作为肠粘膜中最主要的紧密连接蛋白，是决定肠粘膜通透性的关键因素[7]。本研究结果提示醒脾解郁方对两个关键蛋白均有显著提升作用，相较于西药，对肠粘膜屏障损伤的改善作用更显著。

此次研究表明，慢性束缚可较好的制备抑郁动物模型。醒脾解郁方可以显著降低结肠LPS、IL-6、TNF-α含量，提高结肠ZO-1及Occludin蛋白表达，从而改善慢性应激抑郁大鼠结肠炎症反应及肠粘膜屏障损伤，并且相较于西药体现出一定优势。证实从脾论治抑郁症的作用靶点可能在于调节肠道微生态，同时进一步证实中药多靶点、多环节的抗抑郁效应。但醒脾解郁方作为中药，复方成分相对复杂，其抗抑郁效应并非单一机制作用的结果，因此仍需要在多方面同步进行整体性的探究。