胶质母细胞瘤复发相关基因的筛选、表达和临床预后分析

林 艺，王 策，康 勋，康 庄，陈 峰，江 波，李文斌

首都医科大学附属北京天坛医院肿瘤综合治疗中心，北京 100070

脑胶质瘤是常见的中枢神经系统原发性恶性脑肿瘤之一，约占原发性脑肿瘤的30%，原发恶性脑肿瘤的80%［1］。高级别脑胶质瘤［世界卫生组织（World Health Organization，WHO）Ⅲ～Ⅳ级］恶性程度高、侵袭性强，尤其胶质母细胞瘤患者中位总生存期为12～15个月，容易复发，复发后患者的中位总生存期为3～6个月［2-3］。因此，胶质母细胞瘤复发是临床棘手的问题。突破的关键在于深入探究胶质母细胞瘤的发生、发展机制，寻找复发相关的分子标志物，针对相关靶点进行转化研究。在神经肿瘤领域，基因表达谱数据动态分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）和中国脑胶质瘤基因组图谱（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA）数据库已经实现数据公开，为胶质瘤相关的标志物研究提供了新的途径［4-5］。本研究通过对GEO、癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和CGGA等公共数据库进行挖掘，筛选胶质母细胞瘤复发相关基因，并分析表达、临床病理学参数及临床预后的关系。

1 材料和方法

1.1 胶质母细胞瘤相关的基因芯片数据来源

基因芯片数据来源于GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库，检索策略为Recurrent［All Fields］AND (Glioblastoma［MeSH Terms］OR Glioblastoma［All Fields］）。研究纳入标准为采用手术切除样本（原发肿瘤和复发肿瘤均大于10例）进行RNA检测的数据集，排除标准为采用细胞培养或动物模型（Xenograft）等处理过的样本研究。数据集GSE62153和GSE58399符合研究标准，包含胶质母细胞瘤和复发胶质母细胞瘤患者组织标本的样本，表达数据和实验平台等信息见表1。研究通过R软件，下载了标准化的表达数据，利用Biobase、GEOquery和limma等数据包，寻找胶质母细胞瘤复发相关的差异表达基因（differentially expressed gene，DEG），并以P＜0.05，logFC＞1或logFC＜-1作为筛选条件进行后续分析。

表1 研究入选GEO数据集合信息Tab.1 Information about the GEO data and series

1.2 生物信息相关分析

基因功能及通路分析：利用R工具“org.Hs.eg.db”“clusterProfiler”“enrichplot”对DEG进行基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号富集分析。GO分析包括生物过程（biological process）、细胞组成（cellular component）和分子功能（molecular function）3个部分。利用STRING工具构建蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，寻找蛋白质之间的相互作用关系。Hub基因的筛选通过PPI网络，利用Cytoscape中的“Hub”计算生成。生存分析、表达分析使用GEPIA和CGGA数据库相关在线Survival分析工具。STRING、GEPIA和CGGA数据库网址见表2。

表2 生物信息相关在线分析工具Tab.2 Databases related to bioinformatics analysis

1.3 统计学处理

应用R4.0.2软件进行统计分析，使用limma数据包中的Studentt检验方法筛选DEG。在GO通路分析中，数据间差异比较采用ANOVA检验。KEGG中选择差异有统计学意义（P＜0.05）的信号转导通路进行研究。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比较采用log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。癌组织和癌旁组织表达量差异采用配对t检验用来比较，χ2检验比较临床病理学参数组间差异（n＜5时行连续校正χ2检验）。

2 结 果

2.1 胶质母细胞瘤复发相关基因的生物信息学筛选和富集分析

GSE62153数据集纳入病例43例，包括25例原发胶质母细胞瘤和18例复发胶质母细胞瘤病例。GSE58399数据集纳入病例105例，包括72例原发胶质母细胞瘤和33例复发胶质母细胞瘤。GSE62153数据集筛选到40个DEG，上调基因34个，下调基因6个。GSE58399数据集筛选到19个DEG，上调基因16个，下调基因3个。GO功能分析结果提示GSE62153的DEG主要参与中枢神经系统发育、髓鞘、肌动蛋白结合及中枢神经系统髓鞘形成等11个生理过程（表3）。而GSE58399的DEG主要参与上皮细胞迁移的正调控（表4）。KEGG信号转导通路富集分析结果显示，GSE62153和GSE58399的DEG存在共同富集—组氨酸代谢（图1，表4）。

图1 GSE62153数据集KEGG信号转导通路富集Fig.1 Enrichment of KEGG signaling pathway in GSE62153 dataset

表3 GSE62153 GO功能分析结果Tab.3 GSE62153 GO function analysis

表4 GSE58399 GO功能及KEGG信号转导通路富集分析结果Tab.4 GSE58399 GO function and KEGG signal pathway enrichment analysis

2.2 胶质母细胞瘤复发PPI网络构建及Hub基因挖掘

PPI网络构建基于GSE62153和GSE58399筛选出来的DEG，通过STRING数据库，获得PPI网络，共有20个蛋白分子构建成为核心相互作用网络，相关基因为MOG、ASPA、ERMN、PTGDS、MOBP、CLDN11、NKX6-2、CNDP1、SH3GL2、OPALIN、KLK6、MYBPC1、SH3G L3、P LP1、TME M125、AK R1C3、CARNS1、HLA-DPA1、HHATL和SEPP1基因（图2）。而后利用Cytscape软件对构建的PPI网络进行分析和Hub基因挖掘，结果筛选出10个Hub基因，分别为MOBP、OPALIN、ERMN、PLP1、MOG、CLDN11、ASPA、TMEM125、KLK6和NKX6-2基因（图3）。为进一步获得胶质母细胞瘤复发的关键核心基因，通过Venn图工具取出GSE62153和GSE58399芯片的DEG的交集，结果提示共有6个DEG（图4）。最后再选择排名前5的Hub基因与GSE62153和GSE58399筛选出来的DEG取交集，结果提示共有3个基因，分别为ERMN、MOG和MOBP基因。

图2 PPI网络Fig.2 PPI network

图3 Hub基因筛选图Fig.3 Bioinformatics screening of Hub gene

图4 DEG与Hub基因韦恩图Fig.4 Venn diagram of DEG and Hub gene

2.3 ERMN、MOG和MOBP基因mRNA的表达水平与胶质瘤患者预后的关系

为分析ERMN、MOG和MOBP基因在胶质瘤中的预后价值，研究通过GEPIA进行生存分析，Kaplan-Meier法结果显示，在TCGA数据库676例胶质瘤病例中，ERMN、MOG和MOBP基因高表达者预后均优于低表达组，总生存率差异有统计学意义（P＜0.01，图5）。为进一步验证该生存分析结果，研究进一步利用CGGA mRNA芯片数据库进行生存分析，结果显示，ERMN、MOG和MOBP基因与胶质瘤患者的总生存率均显著相关（P＜0.000 1，图5），ERMN、MOG和MOBP基因高表达组预后优于低表达组。

图5 基于TCGA和CGGA胶质瘤病例的生存分析Fig.5 Survival analysis of TCGA and CGGA database

2.4 ERMN、MOG和MOBP基因mRNA在胶质瘤组织中的表达

通过GEPIA分析ERMN、MOG和MOBP基因在胶质瘤中的表达情况。ERMN、MOG和MOBP基因在低级别胶质瘤和对照组织之间的表达水平差异无统计学意义，而在胶质母细胞瘤和对照组织之间差异有统计学意义（图6）。ERMN、MOG和MOBP基因在胶质母细胞瘤组织内的表达水平低于对照组织。研究进一步通过CGGA数据库分析ERMN、MOG和MOBP基因在肿瘤不同分级（WHOⅡ、Ⅲ和Ⅳ级）组织间的表达情况，结果显示，ERMN、MOG和MOBP基因在不同分级组织内的表达差异有统计学意义（P＜0.001），且随着胶质母细胞瘤的级别升高，ERMN、MOG和MOBP基因的表达逐渐降低（图6）。

2.5 ERMN、MOG和MOBP基因mRNA表达水平与胶质瘤临床病理学参数的关系

通过提取CGGA数据库的临床数据和表达谱数据，进一步分析ERMN、MOG和MOBP基因的表达情况与胶质瘤临床病理学参数的关系。结果显示，ERMN、MOG和MOBP基因的表达与WHO分级、异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）状态和临床病理学参数相关（P＜0.001，表5）。MOBP基因的表达与患者年龄（P＜0.001）和MGMT基因甲基化状态相关（P=0.022，表5）。

表5 ERMN、MOG和MOBP基因mRNA的表达水平与胶质瘤临床病理学参数的关系Tab.5 Association between ERMN,MOG and MOBP genes expressions and the patient's clinicopathological characteristics in patients with glioma（n）

3 讨 论

胶质瘤是一类原发于中枢神经系统的常见恶性肿瘤。尽管在过去的几十年中，其治疗已有很大进展，但是大多数患者的临床结局仍然很差。Nieder等［6］报道恶性胶质瘤患者复发后生存时间为6～8个月，而出现第2次进展患者的中位生存期仅为14周。胶质母细胞瘤患者总体预后差，即使接受手术联合放疗和替莫唑胺化疗标准治疗方案治疗，复发率和死亡率仍较高。Stupp方案延长了胶质母细胞瘤患者的总生存期和无进展生存期，但总生存期不足15个月，而5年生存率也低于10%［7］。

文献［8］报道，复发性胶质母细胞瘤患者接受挽救疗法［化疗和（或）再次放疗］的中位生存期为5.3个月。一项纳入167例复发性胶质母细胞瘤患者的Ⅱ期临床试验［9］，将患者随机分入贝伐珠单抗单药治疗和联用伊立替康组，总生存期分别为9.2和8.7个月。一项病例系列研究［10］显示，Ⅳ级患者接受立体定向放疗（stereotactic radiosurgery，SRS）后的中位无进展生存期为4.6个月。复发胶质母细胞患者应用贝伐珠单抗联合SRS（n=20），患者的6个月无进展生存率达65%［11］。2006—2009年一项复发胶母细胞瘤Ⅲ期临床试验［12］将237例复发性胶质母细胞瘤患者按l∶1随机分配接受单纯电场疗法治疗组（n=120）或最优化疗组（n=117），结果显示，肿瘤治疗电场组与最优化疗组的中位总生存期分别为6.6和6.0个月（P=0.27），中位无进展生存期分别为2.2和2.1个月（P=0.16）。复发胶质母细胞瘤尚无标准治疗方案，美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南推荐考虑临床试验。

胶质母细胞瘤具有高度异质性，其进化过程表现出高度分支化特征，按照分支模式及进化速率的估算，与复发相关的克隆往往在诊断前已存在。接受替莫唑胺治疗的胶质母细胞瘤患者中有17%（17/100）复发并伴有高突变肿瘤，但未接受替莫唑胺治疗的患者中没有发生高突变［13］。Nandeesh等［14］研究表明，复发性肿瘤中SOX2表达的显著增加可能表明这些肿瘤中存在具有干样特性的未分化细胞，这种改变可能增加的侵袭性和干性，抵抗放疗和化疗。Zhang等［15］将23例患者切除的标本进行了外显子组测序，该组病例均为初始低级别胶质瘤，而后出现复发性肿瘤，在43%的病例中，至少有一半的初始肿瘤突变在复发时未被发现，包括TP53、ATRX、SMARCA4和BRAF中的驱动突变，10例接受替莫唑胺治疗的患者中有6例肿瘤发展为高级别胶质瘤，复发肿瘤发生超突变，并带有TMZ诱导突变特征，即视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）和蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian targets of rapamycin，mTOR）的驱动突变［15］。Kim等［16］通过采用多基因组学方法分析初次和再次手术的26对配对脑胶质瘤标本，证实复发胶质瘤获得了大量新的基因突变。胶质母细胞瘤复发的两种肿瘤进化途径：大多数局部复发的肿瘤共有大多数初始肿瘤突变，与线性进化一致。在远处复发时，初始和复发肿瘤之间的遗传差异导致关键胶质母细胞瘤驱动基因/途径改变的变化。本研究所选用两个数据集分析产生的DEG交集并不多，这可能是因为胶质母细胞瘤复发后驱动复发增长的基因改变较多，与初始肿瘤不同。

本研究筛选出了胶质母细胞瘤复发相关的关键基因3个，即ERMN、MOG和MOBP基因。ERMN是参与髓鞘形成过程的必需基因，而少突胶质细胞主要是形成髓磷脂的细胞，是叶酸代谢中断的主要靶标［17-19］。在少突胶质细胞成熟过程中，髓鞘特异性蛋白，如蛋白脂蛋白（protein lipoprotein，PLP）和髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）在少突胶质细胞中依次表达。MOG则是一种表达在髓鞘和少突胶质细胞膜的表面糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员。MOG最先由Linnington等［20］于1984年利用小鼠单抗确定并命名，其特异性表达在少突胶质细胞和髓鞘表面的I型膜结合糖蛋白位于髓鞘结构的最外层［21］。在脱髓鞘病变的急性、亚急性及缓解期，MOG抗体均可出现［22］。MOBP是构成中枢神经系统髓磷脂的第三大蛋白质。像髓磷脂碱性蛋白一样，MOBP主要存在于中枢神经系统髓磷脂的致密线，提示在髓磷脂的紧实或稳定中起作用。

通过本次生物信息学分析，我们进一步发现GSE62153和GSE58399的DEG KEGG通路富集分析结果存在交集—组氨酸代谢［23］。组氨酸代谢途径可调节甲氨蝶呤药物敏感性，提示甲氨蝶呤鞘内注射化疗对复发胶质母细胞瘤的治疗价值可能源自于组氨酸代谢。甲氨蝶呤是目前临床广泛应用的抗肿瘤化疗药物，主要适用于白血病和某些其他类型的实体肿瘤，特别是原发性中枢神经淋巴瘤。大剂量甲氨蝶呤是原发性中枢神经系统淋巴瘤的首选治疗方案。Ommaya囊作为中枢神经系统疾病治疗的常用辅助装置，临床常用于脑室内引流与给药，尤其颅内感染和颅内肿瘤的局部用药。1976年Romodanov等［24］对52例恶性脑肿瘤患者进行甲氨蝶呤鞘内注射能够让肿瘤缩小，病理形态学分析提示，其对恶性脑肿瘤具有明显的破坏作用。1991年Nierenberg等［25］对5例多形性胶质母细胞瘤患者给予甲氨蝶呤治疗，尸检发现甲氨蝶呤治疗患者肿瘤组织出现液化性坏死。李丰展等［26］分析了甲氨蝶呤经Ommaya 鞘内注射间质化疗联合同步放化疗胶质母细胞瘤患者，发现其复发时间为（13.61±3.83）个月，中位生存时间为2.10个月（1.35～2.70个月），优于常规放化疗的（10.31±2.20）个月和1.55个月（1.30～2.10个月）。我们团队前期基础研究［27］结果显示，甲氨蝶呤通过下调RAS/MAPK/MYC/CD47信号转导通路，抑制胶质母细胞瘤细胞系U87生长。甲氨蝶呤鞘内注射治疗复发胶质母细胞瘤患者在临床应用中取得了一定的效果，未来应进一步深入研究其具体机制。

综上所述，生物信息学分析结果表明，ERMN、MOG和MOBP基因的表达改变与胶质瘤的临床病理学参数及患者预后有关，有可能成为甄别复发胶质母细胞瘤的标志物。本研究所利用的开放数据库病例涵盖东、西方胶质瘤人群，预后分析结果显示，东西方人群的基因类型并没有显著差异。ERMN、MOG和MOBP基因的预后预测价值还需要进一步利用中国的病例样本在蛋白水平进行验证，以期寻找到诊疗标志物，并对其功能和机制进行研究，为胶质瘤的复发诊断、预后预测提供线索和依据。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。