DNA损伤应答缺陷作为乳腺癌治疗靶点的研究进展

金奕滋，林明曦，张 剑

复旦大学附属肿瘤医院Ⅰ期临床研究中心，复旦大学附属肿瘤医院肿瘤内科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032

乳腺癌现已成为全球范围内发病率最高的恶性肿瘤［1］，得益于乳腺癌的分类治疗模式，其总体预后在近年来有所改善。目前临床上对乳腺癌的分类治疗主要基于其病理学分子分型，即根据雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）及人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的表达情况将乳腺癌分为激素受体阳性型、HER2过表达型和三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）。与此同时，随着测序技术的发展和多组学研究的兴起，基于传统分子分型的分类治疗显现出一定的局限性。尤其对于TNBC而言，尽管具有侵袭性较强、复发及远处转移率高的共同特征，但其基因突变谱和分子生物学特征存在着高度异质性，仍需要确立更精准的分型或寻找针对性靶点来指导临床治疗［2-5］。

DNA损伤应答（DNA damage response，DDR）缺陷是近年来乳腺癌治疗研究的热门靶点之一。中乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）为DNA同源重组（homologous recombination，HR）修复通路上的关键基因，其作为乳腺癌的治疗靶点已得到许多研究［6-7］的证据支持。基于多项大型Ⅲ期多中心临床试验的数据，最新的国际指南已推荐对所有复发或转移性的乳腺癌患者行胚系BRCA1/2突变检测以评估是否存在多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly (ADP-ribose) polymerase，PARP］抑制剂的应用指证，且有研究［6-7］表明，伴胚系BRCA1/2突变的肿瘤表型（即“BRCAness”表型）亦存在于BRCA1/2野生型的伴HR缺陷的肿瘤中，伴HR功能异常的乳腺癌分别占乳腺癌总人群的20%和TNBC的50%～80%。以上证据提示DDR缺陷作为乳腺癌的潜在治疗靶标具有一定的研究价值和应用前景。本文就DDR缺陷作为乳腺癌治疗靶点的研究进展进行综述，并探讨其在临床应用中所面临的问题。

1 DDR缺陷

DDR通路负责DNA损伤后的识别、信号转导和修复，并通过协调细胞周期进程减少DNA损伤被传递至下一代子细胞的可能。DDR功能的失活可导致细胞突变的累积和基因组不稳定性的增加，在癌症发生的早期发挥着关键作用［8-9］。DNA损伤修复的核心机制包括修复DNA单链损伤的碱基切除修复（base excision repair，BER）、核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）、错配修复（mismatch repair，MMR），以及修复DNA双链损伤的HR、非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）、微同源介导的末端连接（microhomologymediated end joining，MMEJ）［10-12］。随着对DNA损伤修复机制的深入研究，现已明确DNA损伤修复是由细胞内的信号转导网络进行感知和调控的复杂过程，不同机制所涉及的通路间存在着相互作用。

在DDR的主要通路中，介导高保真DNA修复的HR通路与乳腺癌发生、发展的关系尤为密切。HR通路上的关键基因BRCA1/2为乳腺癌最常见的易感基因，伴BRCA1/2突变的乳腺癌患者更易呈现早发性（发病年龄≤35岁）、双侧乳腺癌、合并乳腺癌家族史的特点。此外HR缺陷还包括HR通路其他基因（如CHEK1/2、ATM、ATR、BRIP1、PALB2、PTEN、RAD50、RAD51和MSH6等）的体系或胚系突变、BRCA1启动子甲基化以及与HR缺陷表型相关的DNA拷贝数变异、杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）、端粒等位基因失衡（telomeric allelic imbalance，TAI）、大片段迁移（large scale transition，LST）等基因表达特征［13］。

2 DDR与“协同致死”机制

“协同致死”的概念最初用于描述两个功能性基因同时失活导致细胞死亡的现象［14-15］，这一概念在癌症治疗领域被进一步拓展。在伴有DDR某条通路缺陷的肿瘤细胞中，DNA修复将高度依赖于其他旁路途径，而若此时这些通路被药物再次抑制则会产生“协同致死”效应。利用这一效应，DDR成为抗肿瘤药物的研发靶点。

PARP抑制剂为首个成功利用“协同致死”原理进入临床应用的抗肿瘤药物，其开发最初主要基于对PARP催化活性的抑制。研究者最初认为PARP抑制剂可通过抑制PARP酶活性阻断DNA单链损伤后的BER，当单链损伤转变为双链损伤时，正常细胞可通过HR通路对双链损伤进行修复，而HR功能异常的细胞则出现损伤的积累，最终致死。然而，由于后续研究发现抑制BER通路上PARP的下游分子未能杀死HR缺陷细胞［16］，这种对PARP作用机制的阐释又受到了挑战。PARP同时负责调控NHEJ通路，有研究［16-18］发现，在HR缺陷细胞中抑制PARP活性可引起NHEJ通路异常激活，且PARP抑制剂通过NHEJ通路发挥细胞毒作用。由于NHEJ修复不具有保真性，该通路的失调可能是协同致死的机制之一。此外部分PARP抑制剂可通过“PARP捕获”机制形成DNA-PARP复合物使DNA复制叉停滞，进而干扰修复过程中的DNA复制［19-20］。由于PARP捕获机制还可激活固有免疫反应［21］，故捕获能力更强的PARP抑制剂往往具有更强的抗肿瘤作用。

除PARP抑制剂外，多个基于“协同致死”机制靶向DDR的药物正处于临床前及临床研究阶段。这些靶点可大致分为两类：一类为主要负责DNA损伤识别与信号转导、参与调控细胞周期的蛋白激酶，如ATM、ATR、DNA-PKcs、CHEK1/2和WEE1等；另一类为直接参与DNA双链断裂修复的分子，如RAD51和POLQ。ATM主要通过HR通路参与DNA双链断裂修复，其负责H2AX的磷酸化，进而招募下游分子参与DDR过程［22］。ATR在DNA单链和双链修复中均发挥重要作用，其与下游的CHEK1分子共同参与细胞周期捕获，维持复制叉的稳定性，帮助复制叉修复和重启［23］。WEE1负责调控细胞周期激酶，负向调控细胞进入有丝分裂［24］。DNA-PKcs和POLQ则分别是NHEJ通路和MMEJ通路的关键分子［25-26］。

3 以DDR为靶点的乳腺癌治疗药物

3.1 PARP抑制剂

PARP 抑制剂为目前乳腺癌治疗领域研究进展最快的DDR靶向药物。OlympiAD、EMBRACA研究［27-28］的数据已奠定了PARP抑制剂在伴胚系BRCA突变转移性乳腺癌中的治疗地位。OlympiAD Ⅲ期临床试验［28］表明，奥拉帕尼单药对比标准化疗显著改善携带胚系BRCA突变、HER2阴性转移性乳腺癌患者的无进展生存期（progression free survival，PFS）（中位PFS：7.0个月vs4.2个月，P＜0.001），且患者对奥拉帕尼耐受性良好，3级及以上不良反应的发生率低于标准化疗组（36.6%vs50.5%），尽管两者对总生存期（overall survival，OS）的影响无显著差异，但在既往未接受化疗患者的亚组分析中，奥拉帕尼组相比化疗组可显著延长OS（22.6个月vs14.7个月，P＝0.02）。在随后的EMBRACA Ⅲ期临床试验［29］中，新一代PARP抑制剂他拉唑帕尼亦显示出优于标准化疗的抗肿瘤活性［客观缓解率（objective response rate，ORR）：62.6%vs27.2%］，且较标准化疗组可显著延长PFS（中位PFS：8.6个月vs5.6个月，P＜0.001）。基于以上数据，奥拉帕尼和他拉唑帕尼已获美国食品药品管理局批准用于治疗HER2阴性、伴胚系BRCA突变的转移性乳腺癌患者。

此外，多项临床试验亦证明了PARP抑制剂在合并DDR缺陷乳腺癌患者中的治疗价值，其中包括用于辅助治疗和新辅助治疗阶段。TBCRC 048单臂研究［30］的初步结果显示，携带体系DDR突变和非BRCA胚系DDR突变的转移性乳腺癌患者经奥拉帕尼单药治疗后分别取得了38.5%和29.6%的ORR，提示可能有更多非胚系BRCA突变的患者可从PARP抑制剂治疗中获益。而GeparOLA Ⅱ期临床试验［31］结果则提示，奥拉帕尼联合紫杉醇较卡铂联合紫杉醇在合并HR缺陷、HER2阴性早期乳腺癌的新辅助治疗中有着更高的病理学完全缓解（pathologic complete response，pCR）率，且耐受性更好。以上数据均表明，PARP抑制剂可使胚系BRCA突变以外的乳腺癌患者获益，而伴HR缺陷的乳腺癌能否成为PARP抑制剂的又一适应证仍有赖于更多更高级别的证据。

3.2 其他靶向DDR通路的药物

由于PARP抑制剂面临耐药等问题，研究者进一步探索了DDR通路上的其他靶点。除PARP抑制剂外，多个以DDR通路分子为靶点治疗乳腺癌的药物已进入临床研究阶段，如ATM抑制剂、ATR抑制剂、CHEK1抑制剂及WEE1抑制剂等，表1总结了这些药物的临床试验开展情况。随着对DDR调控分子网络的深入研究，相信未来将有更多的靶点投入临床转化研究，有望作为单药或联合PARP抑制剂、免疫治疗、靶向治疗等用于难治性乳腺癌的治疗。

表1 除PARP抑制剂外进入临床研究阶段的主要DDR靶向药物Tab.1 The main agents targeting DDR in the clinical development beyond PARP inhibitors

4 以DDR为靶点的药物在TNBC中的临床进展

由于先前的研究［30-31］证据提示，无胚系BRCA突变患者也可能从PARP抑制剂治疗中获益，而TNBC又是目前临床治疗效果欠佳的一种乳腺癌亚型，一些临床研究以TNBC为目标人群探索DDR靶向药物的治疗价值（表2）。

表2 探索DDR靶向药物治疗TNBC的主要临床研究Tab.2 The main clinical trials investigating DDR-targeted agents for the treatment of TNBC

在TNBC新辅助治疗领域，尽管BrighTNessⅢ期研究［32］表明，维利帕尼+紫杉醇+卡铂组较紫杉醇+卡铂组未能显著提高pCR率（P=0.36），但PETREMAC Ⅱ期研究［33］显示出奥拉帕尼单药序贯化疗的良好疗效，其ORR在非选择性的TNBC中达56.3%，且胚系或体系HR基因突变与BRCA1甲基化状态可能是理想的疗效预测指标。另有一项旨在评估ATR抑制剂ceralasertib单药治疗是否对新辅助化疗后残存病灶较多的TNBC患者具有抗肿瘤作用的Ⅱ期研究正在进行中。对于进展期或转移性乳腺癌，已有OlympiAD Ⅲ期临床试验［28］数据提示TNBC亚组获益更明显，目前多项PARP抑制剂联合免疫或靶向治疗转移性TNBC的临床试验也正在进行中。CHEK1抑制剂prexasertib在一项Ⅱ期临床试验［34］中对无BRCA突变的进展期TNBC显示出中等强度的临床疗效。考虑到prexasertib联合化疗在卵巢癌中的应用取得了一定的成功，有必要进一步评估其联合化疗治疗乳腺癌的临床效果。此外，有多项正在进行中的临床研究旨在评估两种DDR靶向药物的联合应用，例如一项Ⅱ期多中心临床研究VIOLETTE旨在探究奥拉帕尼单药对比奥拉帕尼联合ATR抑制剂ceralasertib或WEE1抑制剂adavosertib作为二线或三线治疗转移性TNBC的疗效和安全性。总的来说，DDR靶向药物的联合治疗（包括免疫治疗、靶向治疗及联合两种DDR靶向药物等）已成为临床研究的趋势，期待以上这些研究结果能为TNBC带来新的治疗机会。

5 临床应用中的难点与挑战

DDR缺陷作为乳腺癌潜在的治疗靶点，在临床应用中仍存在以下尚待解决的问题。

5.1 疗效预测标志物的确立

DDR靶向药物的作用主要基于“协同致死”原理，故需更精准地对目标人群进行定位。尽管目前PARP抑制剂仅获批用于胚系BRCA突变的乳腺癌患者，多项临床研究［30-31］表明，其对无BRCA突变的患者亦具有疗效。而HR缺陷和“BRCAness”表型是否为PARP抑制剂最准确的预测指标，仍需要大型随机对照研究进行验证。此外，HR功能异常作为潜在的预测指标仍缺乏统一的检测手段、标准和明确的定义。目前的预测指标包括HR缺陷评分（将HR缺陷表型相关的LOH评分、TAI、LST等基因表达特征纳入综合考虑）、基于多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）分析的BRCA1样特征、RAD51评分等［13］。这些预测指标能否精确定位治疗人群，仍有待临床试验的进一步评估。

5.2 继发性耐药

PARP抑制剂继发性耐药的机制尚未被完全阐明，目前已知的机制主要包括以下几点：①由于HR基因的回复突变、BRCA1亚等位基因的表达、BRCA1脱甲基化及p53结合蛋白1的失活等原因，HR修复功能得以恢复；② PARP1的完全失活或“PARP捕获”能力的下降；③通过多种机制保护停滞的复制叉不被破坏；④ P-糖蛋白表达上调，使药物外排增加［12，35］。此外，PARP抑制剂与铂类药物存在着交叉耐药现象，前线铂类治疗进展的患者往往对PARP抑制剂响应不佳。PARP抑制剂的耐药问题限制了其进一步的临床应用，故需积极探索克服耐药的策略，例如，针对以上耐药机制开发新型的DDR靶向药物，进一步探究PARP抑制剂与其他DDR靶向药、免疫治疗、化疗等手段联合应用的临床效果等。

5.3 意义不明变异（variants of uncertain significance，VUS）

DDR 通路缺陷的判定依赖于对测序结果的解读。国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）根据基因变异的致病性将其分为5 类：致病突变（可能性＞9 9.0%）、可能致病突变（可能性为9 5.0%～9 9.0%）、VUS（可能性为5.0%～94.9%）、可能良性变异（可能性为0.1%～4.9%）和良性变异（可能性＜0.1%）［36］。目前，治疗及临床试验的对象仅局限于致病或可能致病突变的患者。而实际在DDR基因测序中发现的大量单核苷酸变异仍被归类为VUS。既往WECARE研究［37］表明，约有75%的胚系BRCA1/2突变为VUS；而在ClinVar数据库中，VUS为5类变异中占比最大者。由于VUS的功能影响与实际致病风险尚不明确，给测序结果的临床解读和相应的治疗决策带来了较大困难，亟待进一步的评估与分类。

目前对VUS评估的方法主要有以下几种：①通过功能实验评估VUS对细胞功能的影响（如对HR修复、转录激活功能、分子间相互作用等的影响）［38-39］；②通过生物信息学数据库（如SIFT、Polyphen 2等）对VUS功能进行预测［40-41］；③基于大样本量的基因测序数据，通过对比某种变异在癌症患者与健康人群中的出现频率、携带某种变异的患者是否存在家族聚集性发病等评估变异的致病性；④利用基于CRISPR/Cas9技术的饱和基因编辑（saturation genome editing，SGE）对大批量的VUS进行功能检测和评分［42］。其中，传统的功能实验多基于导入外源性序列的模型进行分析，其灵敏度和特异度受剪接效应、转录稳定性等因素影响，且难以实现高通量的评估，因而具有一定的局限性；而生物信息学算法工具尽管易实现高通量分析，但其准确度相对较低。对于大部分的VUS而言，目前的临床及测序数据尚不足以为其定性提供充分证据。Findlay等［42］创新性地利用SGE对BRCA1基因RING和BRCT功能域上所有位点进行点突变，利用携带失功能BRCA突变的单倍体细胞无法存活的特性，高通量地对单核苷酸变异进行功能意义上的鉴别与分类。其对错义突变和剪切位点的功能评估均有较高的灵敏度和特异度，是目前评估VUS最为准确高效的方法，对完善DDR基因VUS的分类具有重要的借鉴意义。

6 总结与展望

以DDR为靶点的药物在乳腺癌治疗领域应用前景广阔。一系列的临床试验证据表明，PARP抑制剂对治疗乳腺癌有良好的疗效和安全性，同时，多项研究也正在积极探索PARP抑制剂能否在更早期的治疗阶段应用、能否使更多患者从中获益。除PARP抑制剂外，多种靶向DDR通路分子的乳腺癌治疗药物正处于临床前和临床研究中。在进一步的临床应用之前，人们仍需探索更准确的疗效预测指标以精准刻画获益人群；同时需要积极探索克服耐药的策略，联合靶向药物或免疫治疗将有希望成为新的发展方向；最后，仍需要大量的研究数据完善VUS的精准分类，以更好地利用测序数据指导临床治疗。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。