外泌体介导的miR-577在幼儿复发性喉乳头状瘤中的表达及其对细胞增殖和侵袭的影响*

胡彬雅 李赟 敬云龙 赵斯君

喉乳头状瘤为喉部常见的良性肿瘤，与人乳头状瘤病毒感染有关，恶变者多见于中年以上的患者[1]。幼儿型喉乳头瘤与病毒感染及慢性刺激有关，可发生于任何年龄，10岁以下儿童更为多见，具有多发性、生长快，易复发等特点[2]。外泌体(exosome)是由细胞分泌的纳米级小囊泡，几乎可由所有细胞分泌获得，可以作为信息载体在细胞间进行物质和信息的传递[3]。外泌体内包含多种不同分子，如：蛋白质、脂质、DNA、mRNA和miRNA，其中微小核糖核酸(miRNA)在基因表达调控上有着重要作用，并证实外泌体与肿瘤的生长、转移、免疫耐受以及耐药性密切相关[4]。外泌体中的miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，其通过与靶基因特异性结合可参与转录后基因的表达调控[5]。据报道，由外泌体介导的miR-577在多种肿瘤中表达显著下调，被认为是一种有效的抑癌分子[6],且miR-577通过介导Notch信号通路抑制肺癌细胞的增殖、侵袭和耐药性[7]；miR-577作为抑癌基因通过阻断Wnt/β-catenin信号通路降低胶质瘤细胞上皮-间质转化活性,从而抑制肿瘤发展[8]，表明miR-577参与肿瘤的发生发展，是众多肿瘤潜在治疗靶点及其肿物标志物之一。基于目前有关miR-577在喉乳头状瘤中的作用研究尚未见研究报道，因此，本研究拟探讨由外泌体介导的miR-577在幼儿复发性喉乳头状瘤中的表达及其对喉乳头状瘤细胞增殖、侵袭的作用及其可能潜在机制，以期为幼儿喉乳头状瘤的诊断和治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1幼儿喉乳头状瘤及正常喉组织标本采集 收集2016年6月至2019年12月在湖南省儿童医院耳鼻咽喉头颈外科确诊并行手术治疗的30例幼儿喉乳头状瘤组织样本及其相匹配且远离病灶并经病理证实的正常喉组织样本进行研究，所有组织样本于手术中获取，离体后20 min内行快速冰冻病理检查确认，后经石蜡包埋制成组织标本于低温液氮中保存备用。30例喉乳头状瘤幼儿中，男13例，女17例，年龄6～57个月，平均24.3±6.5个月。

1.2实验细胞及实验材料、试剂、仪器 人正常喉上皮细胞株和喉乳头状瘤细胞购自中国科学院上海细胞库。研究所用miR-577从喉乳头状瘤细胞分泌的外泌体中分离获得；RPMI1640培养基、胎牛血清购自美国HyClone公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Trizol、反转录试剂盒和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒购自美国Promega公司；BCA蛋白质定量检测试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；兔抗鼠Notch、兔抗鼠DSL、兔抗鼠MMP-9、兔抗鼠MMP-1和鼠抗GAPDH购自美国Abcam公司；转染试剂LipofectamineTM3000购自美国Invitrogen公司；PCR引物、NC mimic和miR-577 mimic模拟物由北京擎科生物科技有限公司设计、合成。

1.3研究方法

1.3.1正常喉上皮细胞和喉乳头状瘤细胞培养 将正常喉上皮细胞和喉乳头状瘤细胞常规培养于RPMI1640培养液(含10%胎牛血清及双抗)，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱，隔天换液，待细胞融合至80%～90%时进行传代培养用于后续实验。

1.3.2喉乳头状瘤细胞转染 根据目的基因序列设计合成PCR引物，扩增目的基因全长。待喉乳头状瘤细胞培养融合度达90%时，按照Lipofectamine 3000说明书将miR-577 mimic以及阴性对照NC mimic分别转染至细胞中，并设置空白对照，依次设为miR-577过表达组(miR-577 mimic组)、阴性对照组(NC mimic组)和空白对照组(control组)，置于37 ℃、5%CO2条件下继续培养孵育48 h后检测细胞转染效率，实验设置3个重复。

1.3.3实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测喉乳头状瘤组织及细胞中miR-577相对表达 采用Trizol法提取喉乳头状瘤组织及细胞的总RNA并测量其浓度和纯度；按照反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA，并以此为模板按照qRT-PCR试剂盒说明书行PCR反应。引物序列miR-577正向：5’-ACGTTAGCTACACTTGCGTT-3’，反向：5’-AGTGCCGTTGCATACAAAGG-3’；β-actin正向：5’-CTCACCATGGATGATGATATCGC-3’，反向：5’- AGGAATCCTTCTGACCACTGC -3’。反应条件：95 ℃预变性15 min,95 ℃退火30 s,60 ℃延伸90 s，扩增循环40次。采用2-ΔΔCt法以GAPDH为内参计算目标基因相对表达量。

1.3.4双荧光素酶报告基因验证miR-577与Notch的靶向关系 通过TargetScan(http://www.targetscan.org/)数据库预测miR-577的靶基因，发现Notch的3’-UTR区与miR-577存在结合位点，可能是miR-577的靶基因。利用双荧光素酶报告基因试验进行验证，通过扩增Notch基因3’-UTR片段，构建包含miR-577与Notch结合位点在内的野生型(WT)及突变型(MUT)双荧光素酶报告质粒载体(pcDNA3.1-Notch)；利用LipofectamineTM3000转染试剂盒将miR-577 mimics或NC mimic与pcDNA3.1-Notch载体WT型或MUT型共转染至喉乳头状瘤细胞中，每组设3个复孔，于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养24 h，根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明检测荧光素酶活性，实验重复3次取平均值。

1.3.5CCK-8法检测喉乳头状瘤细胞增殖 取对数生长期各转染组喉乳头状瘤细胞，以6×103个/孔密度接种于96孔板，37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h，每孔设3个复孔；向每孔中加入10 μl CCK-8溶液，继续孵育24 h后使用酶标仪于450 nm处测量吸光度(OD)值，OD值越高表明细胞增殖能力越强，实验重复3次取平均值。

1.3.6Tanswell法检测喉乳头状瘤细胞侵袭 取对数生长期各转染组喉乳头状瘤细胞，以1×105个/孔的密度接种于6孔板中，37 ℃，5%CO2培养箱中培养24 h；消化、离心细胞后按照2×104个/毫升用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液；按照每孔200 μl将细胞悬液加入transwell小室，同时在transwell下室加入10%TBS和500 μl培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养；在上室中加入结晶紫染液，5 min后回收染液；在正置显微镜上放置一块载玻片，将transwell小孔倒置放在上面，拍照；在100倍视野下行细胞计数，计算细胞侵袭率，计数越多表明细胞侵袭能力越强。以上实验重复3次，取平均值。

1.3.7Western blot检测Notch、DSL、MMP-1、MMP-9蛋白表达 取对数生长期喉乳头状瘤细胞接种于25 cm2培养瓶中，细胞融合至80%～90%时进行细胞转染。48 h后收集各组细胞加入细胞裂解液4 ℃、12 000 r/min离心30 min，收集上清，采用BCA蛋白质定量检测试剂盒测定蛋白浓度后，取30 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法将分离蛋白转移至PVDF膜上；室温下以含5%脱脂奶粉的Tris缓冲液封闭PVDF膜1 h，分别加入Notch、DSL一抗孵育，4 ℃过夜；TBST清洗膜8 min，重复4次，加入相应的HRP标记的二抗，室温孵育2 h；TBST重复清洗膜4次，ECL发光液显色，在凝胶成像系统中采用Quantity-One 软件分析蛋白含量，以GAPDH为内参。

1.4统计学方法 采用统计软件SPSS 20.0对数据进行分析，细胞不同转染组、多组间比较采用单因素方差(ANOVA)分析，组间两两比较采用LSD-t检验；喉乳头状瘤组织和配对的正常喉组织中表达差异采用配对t检验；喉乳头状瘤细胞及正常喉上皮细胞中表达差异采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1喉乳头状瘤组织及细胞中miR-577表达 qRT-PCR法检测显示，喉乳头状瘤组织中miR-577 mRNA相对表达量(0.134±0.026)显著低于正常喉组织(0.823±0.056)(t=61.123,P<0.001)；喉乳头状瘤细胞中miR-577 mRNA相对表达量(0.256±0.026)显著低于正常喉上皮细胞(0.962±0.072)(t=15.974,P<0.001);表明喉乳头状瘤中miR-577显著低表达。

2.2过表达miR-577对喉乳头状瘤细胞增殖和侵袭的影响 在喉乳头状瘤细胞的control、NC mimic和miR-577 mimic组细胞中miR-577相对表达水平分别为0.965±0.005、1.012±0.094、4.026±0.298，差异有统计学意义(F=283.461，P<0.001)；与control组相比，转染miR-577 mimic后喉乳头状瘤细胞中miR-577相对表达量明显升高(P<0.001)，而control、NC mimic组中miR-577相对表达差异无统计学意义(P>0.05)(图1a)，提示miR-577过表达细胞系构建成功。

CCK-8 法检测miR-577对喉乳头状瘤细胞增殖的影响见表1、图1b，可见与NC mimic组相比，转染miR-577 mimic后48、72 h喉乳头状瘤细胞增殖能力明显降低(P<0.01)。tanswell实验和Western blot实验分别检测miR-577对喉乳头状瘤细胞侵袭能力及侵袭相关蛋白MMP-1、MMP-9表达的影响见表2、图1a～d,可见，与NC mimic组相比，转染miR-577 mimic后喉乳头状瘤细胞侵袭率及MMP-1、MMP-9蛋白表达水平显著降低(P<0.01)，提示miR-577过表达抑制喉乳头状瘤细胞的增殖和侵袭。

表1 NC mimic组与miR-577 mimic组喉乳头状瘤细胞增殖能力(OD值)比较

表2 NC mimic组与miR-577 mimic组喉乳头状瘤细胞侵袭率及侵袭相关蛋白表达比较

2.3miR-577靶向结合Notch Starbase软件预测显示miR-577与Notch的3'UTR区序列存在结合位点(图2a)，通过构建包含两者结合位点在内的Notch野生型(WT-Notch)和突变型(Mut-Notch)荧光素酶报告载体，进一步通过双荧光素酶报告实验进行验证，发现转染miR-577 mimic后WT-Notch组相对荧光素酶活性明显升高(P<0.05)，转染miR-577 mimic对MUT-Notch组荧光素酶活性无影响(图2b);提示Notch是miR-577的靶基因，喉乳头状瘤细胞中miR-577与Notch通路可能存在一定关联。

为明确miR-577与Notch通路的关系，qRT-PCR法检测显示，喉乳头状瘤细胞中Notch、DSL mRNA表达显著高于正常喉上皮细胞(P<0.05)(表3)。Western blot进一步检测发现，转染miR-577 mimic后喉乳头状瘤细胞中Notch(1.012±0.014)、DSL(0.768±0.016)蛋白表达较NC mimic组(分别为2.498±0.286、2.221±0.259)明显降低(分别为t=8.989，P<0.01；t=9.699，P<0.01)(图2c),证明miR-577可通过直接结合与Notch的3'UTR区结合进而抑制Notch通路。

表3 喉乳头状瘤细胞和正常喉上皮细胞中Notch、DSL mRNA表达

2.4miR-577调控Notch通路抑制细胞增殖、侵袭转染miR-577 mimic和pcDNA3.1-Notch后采用CCK-8法、tanswell实验分别检测，可见与NC mimic组相比，转染miR-577 mimic后喉乳头状瘤细胞增殖能力和细胞侵袭率明显降低(P<0.05)，而共转染miR-577 mimic和pcDNA3.1-Notch后细胞增殖能力和细胞侵袭率较单纯转染miR-577 mimic组明显增加(P<0.05)(表4)，提示共转染pcDNA3.1-Notch可逆转miR-577 mimic对喉乳头状瘤细胞增殖、侵袭的抑制作用，表明Notch是miR-577的一个重要靶点，miR-577可能通过调控Notch通路抑制喉乳头状瘤细胞的增殖和侵袭。

表4 Control组、NC mimic组、miR-577 mimic组和miR-577 mimic+Notch组喉乳头状瘤细胞增殖(OD值)、侵袭率比较

3 讨论

虽然喉乳头状瘤在组织学上是良性肿瘤，但其具有多发性、易复发等特征，易造成呼吸道梗阻，多次手术可引起喉狭窄和发声障碍，给患者及其家庭造成沉重的经济和心理负担。特别是近年来随着性病和传染性疾病的增多，小儿喉乳头状瘤有明显增多的趋势，故基于分子生物学角度探讨喉乳头状瘤发生发展的相关分子机制，找寻特异性分子靶标，对其临床治疗具有重要意义。

外泌体(exosome)是一类由细胞分泌的功能性囊泡结构，具有广泛的内容物，其可诱导受体细胞产生大量生物学过程，参与多种生物病理过程，诱导肿瘤的浸润、转移及细胞耐药[3]。研究发现，肿瘤细胞分泌的外泌体参与多种类型肿瘤细胞间通讯、细胞耐药、微环境调节等，其携带的致癌转录因子、致癌mRNAs等参与肿瘤不同阶段的发展[9]，而肿瘤细胞来源的外泌体中某些特异性成分可作为多种肿瘤潜在的诊断及预后标志物[4]。近年研究发现，外泌体能介导肿瘤细胞与周围组织进行信号传导及内容物传递，诱导转移前微环境形成，促进肿瘤细胞的转移，证实多种细胞均可产生外泌体，参与细胞抗原提呈及肿瘤转移[10]。外泌体中携带的miRNAs作为转录或转录后水平的基因组阻滞物抑制mRNA的翻译或促进mRNA降解，被认为是肿瘤发生发展的重要因素[11]。据报道，由外泌体介导的miRNA异常表达会促进或抑制肿瘤的发生发展[12]，即有些miRNA表现出促癌作用，如：miR-125-3p、miR-21-3a以及miR-146a等，而有些miRNA则表现出抑癌作用，如：miR-192-5p、miR-577等[13]。miR-577在多种肿瘤组织和细胞中表达量下调，作为多种恶性肿瘤的抑癌因子，参与多种恶性肿瘤的生物学过程，发挥抑癌作用[14]。此外，miR-577在其他癌症的发展过程中也发挥重要作用。例如，miR-577在肝癌组织中低表达，与恶性临床病理特征有关，其通过抑制Wnt信号通路可抑制肝癌的生长[15]。miR-577可抑制结肠癌肿瘤细胞的增殖，促进结肠癌细胞的化学敏感性[16]。miR-577通过靶向Rab25抑制乳腺癌上皮间质转化和转移，抑制乳腺癌细胞的转移[17]。因此，研究推测miR-577在幼儿喉乳头状瘤的发生发展中也存在某种重要作用。从本研究结果看，miR-577在幼儿喉乳头状瘤组织及细胞中的表达显著低于正常喉组织和正常喉上皮细胞；过表达miR-577显著抑制喉乳头状瘤细胞增殖和侵袭，并抑制侵袭相关蛋白MMP-1和MMP-9表达，提示miR-577在喉乳头状瘤发生发展过程中发挥抑癌基因作用。

癌症的发生发展离不开众多信号通路的调控，Notch通路是肿瘤微环境中最重要的通路之一。Notch信号通路由Notch配体和受体构成，其两者结合导致蛋白水解并释放Notch1激活的胞内结构域，驱动调节相关转录因子及靶蛋白的表达，进而影响细胞的生物学行为[18]。现阶段众多研究证实，Notch信号通路的异常表达或失调与肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移等过程及细胞耐药密切相关，并证实Notch信号通路表达异常是重要的促癌、抑癌因素[19～21]。袁勇等[22]研究表明，Notch2作为Notch通路主要成员在食管鳞状细胞癌组织中表达上调，参与调控细胞的增殖、侵袭、迁移等过程。Yen等[23]研究表明，抗Notch2/3减弱Notch信号通路表达进而减弱了肿瘤细胞的增殖和凋亡能力。骨肉瘤组织及细胞中Notch信号通路相关因子Hes-1异常表达，高侵袭性骨肉瘤细胞株中Notch信号活性明显增高[24];且Notch信号失调存在于乳腺癌、结直肠癌、肺癌等恶性肿瘤中，Notch信号通路的激活是导致众多肿瘤患者预后不良的主要原因之一[25,26]。因此，为明确miR-577影响喉乳头状瘤细胞生物学行为的潜在作用机制，本研究通过检索生物信息学数据库发现miR-577与Notch的3'UTR区存在结合位点，进一步通过双荧光素基因报告实验探究发现miR-577过表达显著降低野生型Notch的荧光素酶活性，提示Notch是miR-577的一个靶基因；文中检测结果显示miR-577过表达显著抑制Notch通路相关蛋白Notch、DSL表达水平，提示miR-577通过直接与Notch-3'UTR区结合可抑制Notch通路。此外，文中结果显示在转染miR-577 mimic的细胞中共转染pcDNA3.1-Notch，可见喉乳头状瘤细胞增殖、侵袭能力较单纯转染miR-577 mimic组明显增高，提示共转染pcDNA3.1-Notch逆转了miR-577 mimic对喉乳头状瘤细胞增殖、侵袭能力的抑制作用，说明Notch是miR-577的一个重要靶点，miR-577可能通过介导Notch通路抑制喉乳头状瘤细胞的增殖和侵袭，但其更深入的分子机制还需继续研究。

综上所述，幼儿喉乳头状瘤组织及喉乳头状瘤细胞中 miR-577显著低表达，过表达miR-577显著抑制喉乳头状瘤细胞的增殖和侵袭；Notch是miR-577的潜在靶点，miR-577可能通过与Notch的3'UTR区结合进而调控Notch信号通路来抑制喉乳头状瘤细胞的增殖和侵袭。