清肝化痰方对H型高血压大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平及颈动脉结构的影响

蒋文波，黄 霞，金 玉，陈 昊，季海刚，徐俊伟，顾 宁

高血压是心血管疾病发生的一种主要危险因素[1]。H型高血压是伴血同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平升高(血Hcy水平≥15 μmol/L)的高血压疾病[2]。炎症通常引发系列生物反应事件，称为急性期反应，其主要由早期反应细胞因子的介导产生。实际上，Hcy通过从血管内皮细胞如白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎性细胞因子的释放进而诱导血管炎症[3]。有研究报道，在肝部炎症反应加重的小鼠模型中，施药后可降低模型小鼠炎性因子表达水平，改善肝组织炎症反应等[4]。

清肝化痰方是江苏省名中医顾宁教授的临床经验方，主要功效为清肝泻火、健脾化痰，适用于治疗高血压肝火亢盛夹痰证。方药组成：冬桑叶10 g，白蒺藜10 g，姜半夏10 g，蒸陈皮10 g，决明子10 g，杭白菊15 g，白茯苓15 g，淡竹茹10 g，炒枳壳10 g，谷精草15 g，炙甘草5 g。清肝化痰方中的冬桑叶、白蒺藜、决明子、杭白菊为君药，清肝泻火；姜半夏、白茯苓、广陈皮、淡竹茹、炒枳壳为臣药，健脾化痰；谷精草为佐药，疏散肝热；炙甘草为使药，调和诸药。本研究旨在探讨清肝化痰方对H型高血压大鼠平均动脉压、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达水平和颈动脉结构的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)雄性30只，鼠龄为9周，体质量200～220 g；SPF级同源正常血压大鼠(Wistar Kyoto rats，WKY)雄性10只，鼠龄9周，体质量(230±10)g。所有大鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.2 实验药品 DL-蛋氨酸粉末购自美国Sigma公司，大鼠饲料购自北京科澳协力饲料有限公司，Hcy试剂盒购自美国BG公司，马来酸依那普利叶酸片(依叶)购自深圳奥萨制药有限公司(批准文号：国药准字H20103723)，清肝化痰方采用天江药业生产的中药配方颗粒。

1.1.3 实验试剂 2%蛋氨酸水溶液：DL-蛋氨酸粉末2 g，加双蒸水定容至100 mL；10%水合氯醛溶液：水合氯醛粉末10 g，加双蒸水定容100 mL。

1.2 构建H型高血压大鼠模型

1.2.1 动物模型制备 选用雄性SHR大鼠30只，适应性喂养1周后，给予2%蛋氨酸溶液10 mL/100 g体质量作为饮用水，连续4周后检测大鼠血浆中Hcy水平，若血浆Hcy≥15 μmol/L，则符合H型高血压大鼠模型的构建标准。

1.2.2 血浆Hcy测定 先连续喂养4周，遵循0.3 mL/100 g体质量的10%水合氯醛，腹腔注射麻醉。采集1 mL血依次注射于含有EDTA抗凝剂的试管中，再以3 000 r/min转速离心15 min，收集上层血浆，全自动生化分析仪Cabas 8000检查Hcy浓度。

1.2.3 造模结果 实验选用SHR、WKY大鼠均无死亡发生。SHR大鼠造模后，若查血Hcy≥15 μmol/L，即符合H型高血压大鼠模型的构建标准，提示造模成功[5]。

1.3 实验分组 采用随机数字表法将符合H型高血压模型的30只SHR大鼠随机分为模型组、依叶组、清肝化痰方组，每组10只。模型组：正常饲养8周。依叶组：正常饲养，加0.06%依那普利叶酸按10 mL/100 g灌胃，每日1次，连续干预8周。清肝化痰方组：在H型高血压大鼠模型构建基础上，正常饲养，同时给予清肝化痰方灌胃，将清肝化痰方颗粒加水200 mL煎煮10 min，剩余药液不足200 mL者加蒸馏水至200 mL备用，按成人体质量200 mL/60 kg(0.003 mL/g)浓度，2倍浓度灌胃，每日1次，连续干预8周。另设对照组：健康饲养的同源正常血压WKY雄性大鼠10只，给予双蒸水作为饮用水，不进行饲料添加处理，按正常饲养标准进行喂养。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 检测大鼠平均动脉压 为了减少测量血压期间实验动物的精神压力，本研究采用Muromachi尾套血压测量仪器(非侵入式)用于本实验。每周使用无创的智能血压计鼠仪BP-2010A检测各组大鼠的收缩压、舒张压。实验当天，在08：00～09：00时，将大鼠称重后再将动脉插管连接到压力传感器上，记录基础脉动血压30 min，每只记录3次，取其平均数值作为测量的血压值。计算大鼠白天的平均动脉压，平均动脉压=(收缩压+2×舒张压)/3。

1.4.2 免疫组化测量大鼠颈动脉中膜厚度(CMT)、颈动脉内径(CAID)、颈动脉中膜横截面面积(CAMT) 将大鼠麻醉后固定在手术台上，颈部去毛后进行切口，取出颈动脉后用磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗干净，然后将这些片段充分浸没在10%中性甲醛溶液中固定过夜，用切片机将样品切成5 μm厚度的组织切片。测量每条颈动脉上的特定区域(从分叉开始)，并进行苏木精-伊红(HE)染色，拍照，各组大鼠颈动脉切片编号并放进盒子里。在Nikon Eclipse TE 2000-U显微镜上使用40倍放大率读取载玻片，通过Image-Pro Plus 6.0图像分析软件采集图像，测定分析各组大鼠的CMT、CAID、CAMT。

1.4.3 蛋白免疫印迹法分析大鼠主动脉中TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表达情况 采用50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)提取4组大鼠主动脉中的总细胞蛋白质。在SDS-11%聚丙烯酰胺凝胶上分离含有30 μg总蛋白质的样品，将100 μL的细胞裂解液和1%苯甲基磺酰氟(PMSF)100 mmol/L和原钒酸钠100 mmol/L加入到每个孔中，在冰上保持15 min。使用12%凝胶通过SDS-PAGE分离30 μg每种蛋白质裂解物，然后将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，用5%脱脂乳[5%牛血清白蛋白(BSA)封闭用于检测磷酸化抗体]封闭非特异性相互作用2 h。用识别大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6(1∶500)的原代兔抗体探测硝酸纤维素，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)缀合的二抗(稀释比为1∶5 000)、New h-肌动蛋白作为内标，ChemiDocTM MP成像系统收集图像，Image Lab软件通过光密度测定法定量免疫印迹上的条带，并统计灰度值进行分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠平均动脉压、舒张压及收缩压比较 药物干预第8周时，模型组、依叶组、清肝化痰方组平均动脉压、舒张压、收缩压均较对照组明显升高(P<0.05)，清肝化痰方组、依叶组平均动脉压、舒张压、收缩压均较模型组降低(P<0.05或P<0.01)，且清肝化痰方组平均动脉压、舒张压、收缩压均较依叶组明显降低(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠实验第8周平均动脉压、舒张压及收缩压比较(±s) 单位：mmHg

2.2 HE染色检测大鼠血管纤维化 药物干预第8周时，通过HE染色检测大鼠血管纤维化，结果显示：模型组较对照组血管纤维化程度明显增加，依叶组和清肝化痰方组较模型组血管纤维化程度明显降低；其中，与依叶组比较，清肝化痰方组血管纤维化程度明显降低。详见图1。

图1 各组大鼠血管纤维化HE染色结果(×400)

2.3 各组大鼠颈动脉CMT、CAID及CAMT比较 药物干预第8周时，显微镜观察并测量各组大鼠颈动脉CMT、CAID、CAMT，结果显示：模型组CMT、CAMT较对照组明显升高(P<0.05)，清肝化痰方组、依叶组CMT、CAMT较模型组明显降低(P<0.05或P<0.01)，且清肝化痰方组CMT、CAMT较依叶组明显降低(P<0.05)。模型组CAID较对照组明显降低(P<0.05)，清肝化痰方组、依叶组CAID较模型组明显升高(P<0.05或P<0.01)，且清肝化痰方组CAID较依叶组明显升高(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠颈动脉CMT、CAID及CAMT比较(±s)

2.4 各组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表达水平比较 药物干预第8周时，采用蛋白免疫印迹技术分析各组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表达水平，结果显示：模型组TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达水平较对照组升高(P<0.05)，依叶组TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达水平较模型组降低(P<0.05)，清肝化痰方组TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达水平较模型组明显降低(P<0.01)。详见图2、图3。

图2 蛋白免疫印迹检测各组炎性因子表达

与对照组比较，＊P<0.05；与模型组比较，#P<0.05，△P<0.01。图3 各组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表达水平比较(A为IL-1β；B为IL-6；C为TNF-α)

3 讨 论

高Hcy诱导的动脉通透性增加可能涉及由细胞因子TNF-α产生的氧化应激。TNF-α是一种促炎细胞因子，可以提高内皮细胞和血管平滑肌细胞氧负离子[6-7]。Hcy可能促进内皮功能障碍，这可能与氧化应激有关，可导致血管系统中促炎途径的激活[8]。实验第8周测量各组大鼠的平均动脉压、舒张压、收缩压，模型组、依叶组较对照组明显升高，依那普利叶酸、清肝化痰方组较模型组降低，其中，清肝化痰方组较模型组降低更明显。H型高血压病人表现出血管内皮细胞的破坏，血管结构发生变化[9-11]。Hcy诱导的H型高血压大鼠模型中，模型组CMT、CAMT较对照组升高，模型组CAID较对照组降低，说明模型组大鼠的颈动脉结构发生了异常变形；而依叶组和清肝化痰方组CMT、CAID及CAMT均较模型组改善，其中清肝化痰方组改善较为明显。

TNF-α是组织炎症的中枢介质之一，诱导其他炎性细胞因子的合成，而IL-6水平升高与心肌梗死风险增加密切相关[12]。Hcy通过从血管内皮细胞因子如IL-6、IL-1β和TNF-α释放炎性细胞因子诱导血管炎症等[13-14]。与对照组相比，模型组TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达均明显升高，清肝化痰方组TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达水平均较模型组降低。Hcy能够诱导主动脉内皮细胞中促炎细胞因子IL-1β和单核细胞趋化蛋白-1的mRNA和蛋白表达[15-16]，因为Hcy和炎症参数似乎与血管疾病的发生有关[17]。研究表明H型高血压大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表达水平明显升高，可能造成颈动脉中膜厚度增加、颈动脉内径减小、颈动脉中膜横截面面积增大。清肝化痰方通过降低H型高血压大鼠的平均动脉压、收缩压、舒张压及TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表达水平，降低血管纤维化，从而很大程度上改善颈动脉异常变形，为中医药治疗H型高血压提供了一定客观证据。