岷江百合WRKY转录因子基因的克隆与功能分析

王自娥，邓 婕，梁婷婷，苏琳琳，葛 锋，刘迪秋

(昆明理工大学 生命科学与技术学院，昆明 650500)

WRKY转录因子是植物响应生物和非生物胁迫反应的关键调控因子，具有长度约60个氨基酸残基的WRKY结构域。WRKY结构域高度保守，在N末端包含短肽‘WRKYGQK’，在C末端包含一个CX7CX23-HXC(C2HC)或CX4-5CX22-23HXH(C2H2)锌指基序[1]。WRKY转录因子的DNA结合结构域结合靶基因启动子中的W-box元件(C/T)TGAC(T/C)，从而激活或抑制靶基因的表达[2-3]。根据WRKY结构域的数目和锌指基序的类型可将WRKY转录因子家族分为3组：第Ⅰ组包含2个WRKY结构域；第Ⅱ组包含1个WRKY结构域和1个C2H2锌指基序；第Ⅲ组也只包含1个WRKY结构域，但锌指基序为C2HC。第Ⅰ组WRKY蛋白可进一步分为2个亚组，Ⅰa含有C2H2锌指基序，Ⅰb含有C2HC锌指基序；第Ⅱ组WRKY蛋白则被分为5个亚组(a—e)[4]。WRKY转录因子作为植物对多种生物胁迫免疫应答的关键调控因子，广泛参与植物应对多种病原菌的防御反应[5]。植物响应病原菌胁迫时，WRKY转录因子对病原菌胁迫呈现出正调节或负调节作用。从辣椒(Capsicumannuum)的基因组中分离出了62个WRKY转录因子基因，绝大多数CaWRKY的表达水平在辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、辣椒斑驳病毒(pepper mottle virus)、烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)和黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus)侵染过程中上调[6]。在单胞锈菌(Uromycesvignae)侵染的早期，赤豆(Vignaangularis)VaWRKY33迅速响应并起到正调控作用[7]。在烟草(Nicotianatabacum)中瞬时表达甘蔗(Saccharumspp.)ScWRKY5使烟草对茄腐镰刀菌(Fusariumsolanivar.coeruleum)表现出更高的敏感性。并且ScWRKY5的瞬时表达导致烟草中超敏反应(hypersensitive response，HR)标记基因NtHSR515及水杨酸(salicylic acid, SA)信号通路相关基因NtPR-1a/c和NtPR2的转录水平下降，ScWRKY5通过抑制HR和SA信号通路相关基因的表达负调控甘蔗对茄腐镰刀菌的抗性[8]。从芍药(Paeonialactiflora)的转录组数据中筛选了一个差异表达的PlWRKY65基因，通过病毒诱导的基因沉默降低PlWRKY65的表达后，芍药植株对细链格孢(Alternariatenuissima)更加敏感，表现出更严重的感染症状，且PlWRKY65表达量的下降会导致PlPR2、PlPR4B、PlPR5和PlPR10的表达显著降低[9]。

百合(Lilium)是世界上著名的鲜切花，深受世界各国人民的喜爱。但是百合容易感染主要由尖孢镰刀菌(F.oxysporum)引起的枯萎病，枯萎病会导致百合根部腐烂坏死，影响百合的产量和品质，给百合的生产带来严重的经济损失。岷江百合(L.regaleWilson)为中国特有的野生百合，主要分布于中国四川西部，具有极强的抗真菌、抗病毒特性，是培育百合抗病品种的重要种质资源[10]。前期研究表明过表达岷江百合LrbZIP1、Lr14-3-3、LrGSTU5和LrPR10s等抗病基因的烟草对尖孢镰刀菌具有较强的抗性[11-14]。通过岷江百合转录组测序得到了一系列响应尖孢镰刀菌侵染的WRKY转录因子基因[15]。同时发现，岷江百合在被尖孢镰刀菌侵染后WRKY转录因子基因LrWRKY4的表达量显著上调，并在根中大量表达。信号分子SA、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、乙烯利(ethephon, ETH)和过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)处理后均能不同程度上调LrWRKY4在岷江百合根中的转录水平。因此推测LrWRKY4可能参与岷江百合抗尖孢镰刀菌的防御反应。本研究分析了LrWRKY4的生物学功能。首先通过在洋葱(Alliumcepa)表皮细胞中瞬时表达GFP-LrWRKY4融合蛋白，分析其在植物细胞中的表达部位。将LrWRKY4转入模式植物烟草中过量表达，分析转基因株系对尖孢镰刀菌的抗性。同时对JA/SA信号途径相关基因及部分抗病相关基因在转基因烟草株系中的转录水平进行分析。此外，在岷江百合鳞片中瞬时表达LrWRKY4的RNAi片段，分析LrWRKY4表达量降低对尖孢镰刀菌抗性和JA/SA信号途径的影响。

1 材料和方法

1.1 材 料

岷江百合采集于四川省汶川县，种于昆明理工大学生命科学与技术学院温室中。用于遗传转化实验的烟草种子由本课题组保存，种子经表面消毒后播种于1/2 MS培养基上，继代培养5周后的无菌烟草幼苗用于遗传转化实验。尖孢镰刀菌由本课题组从具有典型枯萎病症状的西伯利亚百合中分离、鉴定和保存，使用前在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上培养活化。

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆与生物信息学分析根据转录组测序获得的LrWRKY4的基因序列设计特异性引物(表1)，通过PCR克隆得到LrWRKY4的开放阅读框(ORF)，扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。然后将PCR产物连接到pGEM-T载体(Promega, USA)，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过PCR筛选pGEM-T-LrWRKY4阳性克隆送北京擎科生物科技有限公司测序验证。

将LrWRKY4所编码的氨基酸序列在NCBI tblastn (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在线软件进行同源分析查找相似蛋白。利用ClustalW 1.83软件对LrWRKY4的氨基酸序列进行多重比对分析；用ExPASY-ProtParam (http://web.expasy.org/ protparam/)在线软件分析LrWRKY4的理化性质；用ScanProsite (http://prosite.expasy.org/scanprosite/)在线软件分析LrWRKY4的结构域。

1.2.2 亚细胞定位以pGEM-T-LrWRKY4为模板，设计带有BamHⅠ和XbaⅠ限制性酶切位点的特异性引物(表1)，通过PCR获得不含终止密码子的LrWRKY4 ORF。使用BamHⅠ和XbaⅠ对pBIN m-gfp5-ER载体进行酶切，然后通过T4DNA连接酶将LrWRKY4 ORF连接到酶切后的载体中，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过PCR筛选pBIN m-gfp5-ER-LrWRKY4阳性克隆。采用冻融法将重组质粒转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105菌株中，通过PCR筛选阳性克隆。将包含重组质粒的农杆菌转化到洋葱表皮细胞中进行瞬时表达，以包含pBIN m-gfp5-ER空载体的农杆菌EHA105菌液为阳性对照。24 h后用核定位标记碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料对洋葱表皮细胞进行染色，随后在激光共聚焦扫描显微镜(Nikon, Japan)下观察LrWRKY4的亚细胞定位。

1.2.3 植物过表达载体的构建及烟草的遗传转化以限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ为识别位点，设计基因特异性引物(表1)，以pGEM-T-LrWRKY4为模板通过PCR获得LrWRKY4 ORF。将目的片段连接到pCAMBIA2300s载体中，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过PCR筛选出含pCAMBIA2300s-LrWRKY4重组质粒的阳性克隆。将重组质粒转入根癌农杆菌LBA4404菌株中，经PCR筛选出阳性克隆后转化野生型(WT)烟草叶盘。烟草遗传转化参照张应鹏等[16]的实验方法。使用CTAB法提取转基因烟草基因组DNA，采用LrWRKY4的特异性引物进行PCR，筛选阳性转基因烟草植株。随机挑选阳性转基因株系在温室内自交培育T2代转基因株系。

1.2.4 转基因烟草中LrWRKY4的表达及对尖孢镰刀菌的抗性通过qRT-PCR分析LrWRKY4在随机选择的T2代转基因烟草株系中的表达水平。总RNA提取、cDNA合成、qRT-PCR反应体系、扩增条件参照Liu等[17]的实验方法，每个qRT-PCR实验包含3个生物学重复。以烟草肌动蛋白基因NtACT(AB158612.1)为内参基因，用2-ΔΔCt法分析相关基因的相对表达值。用于qRT-PCR的基因特异性引物见表1。

表1 实验所用引物

为了进一步验证LrWRKY4的功能，选取基因表达水平较高的T2代转基因烟草株系进行抗病性分析。选择生长状态相同、大小均一的WT和T2代转基因烟草幼苗叶片，用无菌砂纸在叶片相同位置进行伤害处理，然后在伤口处接种200 μL尖孢镰刀菌孢子悬浮液(2×106孢子/mL)。将感染的叶片平铺在滤纸上，放在28 ℃气候箱中培养7 d。此外，还在T2代转基因烟草株系和WT烟草的根部接种尖孢镰刀菌。用剪刀将烟草根部剪出伤口，然后浸入尖孢镰刀菌孢子悬浮液(2×106孢子/mL)中30 min，水培7 d后收集烟草，记录发病情况，并使用Photoshop软件计算叶片病斑面积。每个单株包含3个生物学重复。

1.2.5 转基因烟草中防卫相关基因的转录水平挑选LrWRKY4基因表达水平较高的T2代转基因烟草株系，通过qRT-PCR分析一些防卫相关基因在转基因烟草株系中的转录水平。包括JA生物合成途径相关基因NtLOX(脂氧合酶)、NtAOC(丙二烯氧化物环化酶)、NtOPR(12-氧代植二烯酸还原酶)、NtJMT(茉莉酸羧基转甲基酶)、NtAOS(丙二烯氧化物合成酶)、NtPACX(酯酰基-Co氧化酶)，病程蛋白相关基因NtGlu2(β-1,3-葡聚糖酶2)、SA信号途径标记基因NtPR1(病程相关蛋白1)，超氧化物歧化酶NtSOD、NtCu-ZnSOD和NtMnSOD，以烟草肌动蛋白基因为内参基因。用于qRT-PCR的基因特异性引物见表1。

1.2.6LrWRKY4 RNAi片段在岷江百合鳞片中瞬时表达及对尖孢镰刀菌的抗性设计带有attB接头的特异性引物(表1)扩增LrWRKY4的RNAi片段(463 bp)。使用Gateway®BP ClonaseTMⅡEnzyme Mix kit (Invitrogen, USA)将PCR产物与pHellsgate2载体进行BP重组反应，然后转化大肠杆菌DH10B感受态细胞。再将pHellsgate2-LrWRKY4重组质粒进一步转化至根癌农杆菌EHA105菌株中，通过PCR筛选阳性克隆。

用无菌砂纸对健康的岷江百合鳞片进行伤害处理，放在潮湿的滤纸上保湿。将含有重组质粒pHellsgate2-LrWRKY4和空载体pHellsgate2(对照)的农杆菌悬浮液(50 μL)分别滴加到岷江百合鳞片伤口处，然后将鳞片置于28 ℃气候箱中培养24 h，使载体在岷江百合鳞片中瞬时表达，提取此时百合鳞片总RNA，并通过qRT-PCR检测瞬时表达RNAi片段后百合鳞片中LrWRKY4的表达水平及JA信号途径相关基因LrAOS、LrOPR、LrPDF1.2(植物防御素)，SA信号途径相关基因LrICS(异分支酸合酶)、LrPAL(苯丙氨酸解氨酶)的表达情况。然后在伤口处接种200 μL尖孢镰刀菌孢子悬浮液(2×106孢子/mL)，置于28 ℃气候箱中继续培养72 h后收集百合鳞片，拍照记录发病症状，使用Photoshop软件计算鳞片病斑面积。最后提取百合鳞片总RNA，逆转录合成cDNA并进行qRT-PCR实验，以岷江百合三磷酸甘油醛脱氢酶LrGAPDH(JZ391059)为内参基因。用于qRT-PCR的基因特异性引物见表1。

1.2.7 统计分析基因表达水平和病斑面积均采用均值和标准差表示。使用SPSS统计分析软件对所得数据进行分析和处理，野生型和转基因植株之间的统计差异采用t检验进行分析。

2 结果与分析

2.1 LrWRKY4的生物信息学分析

从岷江百合中分离到一个WRKY转录因子基因LrWRKY4(MW125549)，全长cDNA为1 138 bp，开放阅读框为993 bp，5′非翻译区为68 bp，3′非翻译区为77 bp。生物信息学分析表明，LrWRKY4编码含330个氨基酸残基的蛋白质，预测分子量大小为36.8 kD，理论等电点约为6.32。序列分析显示LrWRKY4蛋白含有一个高度保守的‘WRKYGQK’七肽序列和一个C2H2锌指基序，说明LrWRKY4属于WRKY转录因子家族的Ⅱc组(图1，A)。LrWRKY4的氨基酸序列与一些单子叶植物WRKY蛋白序列高度相似(图1，B)。

A. LrWRKY4蛋白结构分析；B. LrWRKY4的氨基酸序列与4条同源序列进行多重比对：Ll. 麝香百合(QIL87957.1)；Eg. 油棕榈(XP_010924354.1)；Ca. 椰子(KAG1367963.1)；Dc. 铁皮石斛WRKY71(XP_020688893.1)图1 LrWRKY4蛋白二级结构预测及序列比对A. The protein structure analysis of LrWRKY4; B. The multiple alignment of LrWRKY4 and four homologous sequences: Ll. L. longiflorum (QIL87957.1); Eg. Elaeis guineensis (XP_010924354.1); Ca. Cocos nucifera (KAG1367963.1); Dc. Dendrobium catenatum (XP_020688893.1)Fig.1 Secondary structure prediction and sequence alignment analysis of LrWRKY4 protein

为了确定LrWRKY4的亚细胞定位，构建了GFP-LrWRKY4融合载体，并通过根癌农杆菌介导的方法将其转化到洋葱表皮细胞中进行瞬时表达。如图2所示，在激光共聚焦显微镜下，GFP-LrWRKY4融合蛋白表达的绿色荧光特异性地分布在洋葱表皮细胞的细胞核中，且与核定位标记PI共定位。而作为对照的GFP蛋白在整个细胞中都能观察到绿色荧光信号。这表明LrWRKY4是一个细胞核定位蛋白。

图2 GFP-LrWRKY4融合蛋白在洋葱表皮细胞中的瞬时表达Fig.2 Transient expression of GFP-LRWRKY4 protein in onion epidermal cells

2.3 LrWRKY4在烟草中的表达及对尖孢镰刀菌的抗性

为了进一步分析LrWRKY4的生物学功能，构建了植物过表达载体pCAMBIA2300s-LrWRKY4，将其转化至模式植物烟草中。以烟草基因组DNA为模板进行PCR，共筛选出45株T0代阳性转基因烟草(图3)。将转基因烟草植株培养于温室中，通过连续自交，得到T2代烟草种子，并培养无菌苗。再生的LrWRKY4转基因烟草与野生型烟草在表型上无明显差异。通过qRT-PCR分析LrWRKY4在WT和11株T2代转基因株系(L4-1/3/5/6/18/19/28/32/33/34/37)幼叶中的表达水平。结果表明，LrWRKY4在11个转基因烟草株系中均有表达(图4)。其中在L4-37株系中的表达水平最高，在L4-3和L4-28株系中的相对表达水平较低。表明LrWRKY4能够在转基因烟草中稳定表达。

M. DL2000；1-15. 转基因烟草；+. pGEM-T-LrWRKY4；-. 野生型烟草图3 转LrWRKY4基因烟草的PCR检测M. DL2000; 1-15. Transgenic tobacco; +. pGEM-T-LrWRKY4; -. Wild-type tobaccoFig.3 PCR detection of LrWRKY4 transgenic tobacco

WT. 野生型烟草；采用t检验进行统计学差异分析，** 表示与WT相比在0.01水平差异显著，图5、6同图4 T2代转基因烟草株系中的LrWRKY4表达WT. Wild-type tobacco; The t test was used to analyze the statistical difference; ** means the significance difference compared with WT at 0.01 level, the same as Fig.5 and Fig.6Fig.4 The expression of LrWRKY4 in T2 generation transgenic tobacco lines

为了评估LrWRKY4转基因烟草的抗性水平，将烟草根部接种尖孢镰刀菌孢子悬浮液后水培7 d。结果显示，WT烟草根部明显变黑甚至腐烂，叶片开始萎缩，而T2代LrWRKY4转基因烟草株系的根部健康，未出现发黑，叶片仍然保持舒展状态(图5，A)。此外，叶片接种实验也表现出相同的结果。烟草叶片接种尖孢镰刀菌孢子悬浮液7 d后，转基因烟草叶片只在接种的伤口附近出现了轻微黄化，伴随着小面积的腐烂，而WT烟草叶片病斑沿着伤口扩大且出现大面积腐烂黄化(图5，B)。WT叶片的病斑面积达325 mm2，转基因烟草株系的病斑面积均低于50 mm2(图5，C)。这些结果表明LrWRKY4基因在烟草中的过表达提高了烟草对尖孢镰刀菌的抗性。

A. 根部接种尖孢镰刀菌；B. 叶片接种尖孢镰刀菌；C.接种尖孢镰刀菌后叶片的病变面积图5 T2代转LrWRKY4基因烟草的抗性分析A. The roots were inoculated with F. oxysporum; B. The leaves were inoculated with F. oxysporum; C. Lesion area of leaves after F. oxysporum inoculationFig.5 Resistance analysis of T2LrWRKY4 transgenic tobacco lines

2.4 LrWRKY4转基因烟草中相关防卫基因的转录水平

选择4个LrWRKY4表达量较高的转基因烟草株系(L4-19/33/34/37)进行进一步的检测分析，通过qRT-PCR分析JA生物合成途径相关基因、病程蛋白相关基因SA信号途径标记基因及抗氧化相关基因在转基因烟草株系和WT烟草中的表达水平。结果如图6所示，与WT烟草植株相比，参与JA生物合成途径相关基因NtLOX、NtAOC、NtOPR、NtJMT、NtAOS、NtPACX的表达量在LrWRKY4转基因烟草中均有明显上调。其中NtJMT在L4-33转基因株系中与WT相比上调了11.7倍，NtAOC在L4-19转基因株系中与WT相比上调了10.8倍。病程蛋白相关基因NtGlu2、SA信号途径标记基因NtPR1在LrWRKY4转基因烟草株系中相对表达量也均有上调，NtGlu2、NtPR1在L4-33转基因株系中的表达水平分别达到了WT烟草的22和12.5倍。逆境响应相关的3种超氧化物歧化酶基因NtSOD、NtCu-ZnSOD、NtMnSOD在转基因烟草中的相对表达量也有不同程度上调。总之，LrWRKY4基因在烟草中的过表达，引起了烟草中JA/SA信号途径相关基因的表达上调，还诱导了部分病程蛋白相关基因以及抗氧化相关基因的表达，以增强烟草对尖孢镰刀菌的抗性。

图6 T2代转LrWRKY4基因烟草株系中11个防卫相关基因的表达水平Fig.6 The expression levels of 11 defense-related genes in T2LrWRKY4 transgenic tobacco lines

2.5 LrWRKY4 RNAi片段在岷江百合鳞片中的瞬时表达

在岷江百合鳞片中瞬时表达LrWRKY4 RNAi载体，从而分析LrWRKY4表达下调对尖孢镰刀菌抗性。通过农杆菌介导LrWRKY4 RNAi载体在百合鳞片中瞬时表达，然后接种尖孢镰刀菌孢子悬浮液。接种72 h后，RNAi载体浸染后和RNAi空载浸染后的岷江百合鳞片均有明显的腐烂现象(图7，A)。通过对病斑面积进行测量和计算，发现LrWRKY4 RNAi载体浸染后的岷江百合鳞片的腐烂程度远远大于RNAi空载浸染后的鳞片，前者的平均病变面积约为100 mm2，后者的病变面积不到20 mm2(图7，B)。同时，qRT-PCR结果显示，瞬时表达LrWRKY4 RNAi载体的鳞片与对照相比，LrWRKY4的表达水平降低了约45.7%，表明RNAi能够降低LrWRKY4在百合鳞片中的表达量；此外，瞬时表达LrWRKY4 RNAi载体的鳞片在接种尖孢镰刀菌72 h后，LrWRKY4的表达水平与对照相比下降了约93.8%(图7，C)。可见在岷江百合鳞片中LrWRKY4表达量的降低增加了岷江百合对尖孢镰刀菌的敏感性。

A. 接种尖孢镰刀菌72 h后RNAi载体和空载的岷江百合鳞片；B.尖孢镰刀菌感染后岷江百合鳞片的病变面积(** P < 0.01)；C. RNAi载体及空载中LrWRKY4表达水平(* P < 0.05，** P < 0.01，图8同)图7 LrWRKY4 RNAi在岷江百合鳞片中的瞬时表达分析A. The RNAi vector and empty RNAi vector scales of L. regale inoculation F. oxysporum after 72 h; B. The L. regale scale lesions area caused by F. oxysporum infection (** P < 0.01); C. Expression levels of LrWRKY4 in RNAi vector and empty RNAi vector (* P < 0.05, ** P < 0.01, the same as Fig.8)Fig.7 Analysis of the LrWRKY4 RNAi transiently expressed in L. regale scales

2.6 LrWRKY4 RNAi瞬时表达的岷江百合鳞片中JA/SA信号途径相关基因的表达

为了分析LrWRKY4表达下调对JA/SA信号途径的影响，检测了LrWRKY4 RNAi瞬时表达的岷江百合鳞片中JA/SA信号途径相关基因的表达水平。结果表明，LrWRKY4 RNAi瞬时表达后24 h SA信号途径相关基因LrICS、LrPAL的表达量与对照相比分别下降了11.8%和8.2%；接种尖孢镰刀菌72 h后， 2个基因的表达量与对照相比分别降低了47.9%和43.4%(图8)。此外，JA信号途径相关基因的表达水平与对照相比显著下调，LrAOS、LrOPR和LrPDF1.2的表达量分别下降了38.3%、76.9%和36.5%；接种尖孢镰刀菌72 h后，3个基因的表达水平分别降低了73.9%、92.5%和82.3%。这些结果表明LrWRKY4表达量的降低下调了几个JA/SA信号途径相关基因的表达水平。

图8 瞬时表达LrWRKY4 RNAi的岷江百合鳞片中JA/SA信号途径相关基因的表达Fig.8 Expression levels of JA/SA signaling pathway related genes in the L. regale scales with LrWRKY4 RNAi transient

3 讨 论

WRKY转录因子家族是一大类植物转录调控因子，参与多种生物学过程，包括生物和非生物胁迫反应、激素反应、生长发育和次生代谢[18-20]。岷江百合是中国重要的百合抗病种质资源，在前期的研究中发现一些岷江百合WRKY转录因子响应尖孢镰刀菌的诱导[15]。从中分离得到了LrWRKY4转录因子，结构分析表明LrWRKY4蛋白含有一个高度保守的‘WRKYGQK’七肽序列和一个C2H2锌指基序，说明LrWRKY4属于WRKY转录因子家族的Ⅱc组。已有研究证实，许多Ⅱc类WRKY转录因子正调控植物对生物和非生物胁迫的防卫反应[21-23]。亚细胞定位结果表明LrWRKY4表达于细胞核中，可能作为转录因子调节靶基因的转录。在前人的研究中，一些WRKY转录因子也显示了类似的定位模式[24]。如香蕉(Musaacuminata)的MaWRKY31、MaWRKY33、MaWRKY60、MaWRKY71，番茄(Solanumlycopersicum) SlWRKY6均定位于细胞核[25-26]。

通过转基因技术进行转录因子基因的异位表达，进而分析转基因植株中基因转录水平的变化，从而可以分析转录因子的功能以及调控网络。SpWRKY3在番茄中的过表达正调控番茄对致病疫霉(P.infestans)的防御反应，表现为坏死细胞数量减少、病斑面积变小和病害指数降低，而SpWRKY3沉默后，番茄对致病疫霉抗性减弱[27]。OsWRKY80在水稻(Oryzasativa)中的过表达显著增强了对纹枯病(Rhizoctoniasolani)的抗性，并上调了转基因株系中病程相关蛋白基因PR1a、PR1b、PR5和PR10的转录水平。而OsWRKY80 RNAi的表达则显著降低了水稻对纹枯病的抗性，上述病程相关蛋白基因在OsWRKY80 RNAi株系中的表达水平均下降[28]。在本研究中，利用反向遗传学技术验证了LrWRKY4的功能。LrWRKY4转基因烟草表现出了对尖孢镰刀菌较强的抗性。瞬时表达LrWRKY4 RNAi载体的岷江百合鳞片与对照相比表现出更大的腐烂程度和发病面积，表明LrWRKY4在岷江百合鳞片中的表达下降增加了对尖孢镰刀菌的敏感性。上述结果表明，LrWRKY4是岷江百合防御枯萎病病原菌尖孢镰刀菌的正调节因子。

在菊花(Chrysanthemummorifolium)中，外源性SA能强烈诱导CmWRKY15-1的表达，在易感菊花中过量表达CmWRKY15-1增强了转基因植株对柄锈菌(Pucciniahoriana)的耐受性，并且提高了内源SA含量和SA生物合成基因的表达。而在相同条件下，CmWRKY15-1 RNAi植株表现出相反的结果，其对柄锈菌的敏感性增加，内源SA含量降低，表明CmWRKY15-1通过SA信号途径在菊花对柄锈菌的抗性中发挥正调控作用[29]。烟草NtWRKY50是一个受多种胁迫因子诱导的基因，马铃薯Y病毒(potato virus Y)、纹枯病(R.solani)及黑胫病菌(P.parasitica)侵染、非生物胁迫(热胁迫、冷胁迫及伤胁迫)和信号分子处理(SA、JA、H2O2及ETH)均能诱导NtWRKY50的表达。NtWRKY50在烟草中过表达导致SA和JA含量上升以及防御相关基因(PR3、H1N1、PR1B、PR2、ACS1和EFE26)的表达量上升[22]。我们的前期研究也表明，SA、MeJA、ETH和H2O2的处理诱导了LrWRKY4的表达量[15]。本研究获得了过表达LrWRKY4的转基因烟草株系，分析发现JA/SA信号途径相关基因(NtLOX、NtAOC、NtAOS、NtJMT、NtOPR、NtPACX、NtPR1)的表达与WT烟草相比显著上调。而在RNAi 的百合鳞片中则表现出相反的结果，JA/SA信号途径相关基因(LrAOS、LrOPR、LrPDF1.2、LrICS、LrPAL)的表达均下降。此外，几个病程相关蛋白基因(NtGlu2)、抗氧化胁迫相关基因(NtSOD、NtCu-ZnSOD、NtMnSOD)的转录水平在转基因烟草中均有不同程度的上升。可见，LrWRKY4可能参与JA/SA信号途径调节岷江百合对枯萎病菌的抗性。

综上所述，LrWRKY4编码一个定位于细胞核的Ⅱc类WRKY转录因子。过表达LrWRKY4的转基因烟草对尖孢镰刀菌表现出较强的抗性，并且上调了烟草中一系列JA/SA信号途径相关基因、病程相关蛋白基因以及抗氧化胁迫相关基因的表达水平，从而增强了烟草对尖孢镰刀菌的抗性。此外，LrWRKY4 RNAi片段的瞬时表达降低了JA/SA信号途径相关基因的表达并增强了岷江百合对尖孢镰刀菌的敏感性。这些结果表明，LrWRKY4在岷江百合的免疫应答中起到正调控作用，可能通过参与JA/SA介导的信号传导途径，诱导防卫相关基因的表达从而调节岷江百合对尖孢镰刀菌的抗性。本研究的开展有助于揭示珍稀抗病种质资源岷江百合响应尖孢镰刀菌侵染的抗性分子机理。