AM真菌对留兰香和常夏石竹耐盐性的影响

徐嘉美，郭静怡，吴 杨，杨春雪

(东北林业大学 园林学院，哈尔滨 150000)

土壤盐渍化已成为一个重大的全球农业问题，威胁到与粮食安全、农业、资源保护和营养相关的可持续发展目标，较高的盐分水平对土壤理化、生物学特性和植物代谢有不利影响[1]。随着人口的增长、灌溉面积的扩大等因素影响，越来越多的荒地将被开垦成耕地，盐渍化现象将更为严重[2]。而利用微生物对盐渍化土壤进行修复是盐渍化土壤改良的重要途径之一[3]。丛枝菌根(AM)真菌是自然界普遍存在的一种共生微生物，与植物共生后可显著提高植物的抗逆性[4]。在盐胁迫条件下，AM真菌可改善土壤环境，改变植物根系形态，从而增加植物对养分和水分的吸收利用，增强植物对盐胁迫的耐受程度并改善植物的生长[5]。研究表明，接种AM真菌可以提高桢楠的光合色素含量[6]，还能减轻渗透胁迫与离子毒害、降低丙二醛的积累，从而减轻盐碱胁迫对杜梨造成的过氧化损伤[7]。AM真菌种类丰富，相关研究发现[8-9]，摩西斗管囊霉(Glomusmosseae)在改善植物耐盐性方面效果较明显。

留兰香(Menthaspicata)为唇形科薄荷属的多年生草本植物[10]。前期研究表明[11]，与留兰香同属植物椒样薄荷(Menthapiperita)能够在150 mmol/L NaCl胁迫下正常生长，由此可知留兰香可能也具有一定的耐盐性。常夏石竹(Dianthusplumarius)是石竹科石竹属的多年生草本植物[12]，其花色艳丽、花期较长、适应性强且具有较强的耐旱性，在园林绿化中应用广泛[13]。留兰香植株叶片较大且覆盖性强，同时具有茂密发达的根系；常夏石竹叶量大，长势较强，且二者均具有植株低矮的特点，可作为地被植物应用。另外，目前对于留兰香的研究主要集中于其药用价值方面，对常夏石竹的研究则主要集中在耐旱性方面，鲜见有关两种植物耐盐性及接种AM真菌对其耐盐能力影响的研究。本研究以留兰香和常夏石竹为试验材料，考察接种AM真菌对不同盐胁迫水平下留兰香和常夏石竹侵染特性与生理指标的影响，探究在接种AM真菌条件下两种植物对一定浓度盐胁迫的响应，以期为两种植物广泛应用于盐渍化土壤种植提供理论依据，同时为盐渍土绿化植物的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与培养

常夏石竹种子购自江苏省宿迁市沭阳县风之月园林绿化苗木场。种子用清水浸泡30 min并经0.3% KMnO4消毒15 min后用蒸馏水冲洗3次，然后将种子置于铺有湿润双层滤纸的培养皿中；待种子大部分露白后均匀撒播于花盆中；当常夏石竹幼苗长出3～4片真叶时进行移栽并接种菌剂，每盆5株。留兰香植株购买于黑龙江省哈尔滨市花卉大市场，挑选健壮、长势一致的枝条，剪成10 cm左右的茎段并保留4～5片叶，接着将茎段插入栽培基质中，生根期间每天喷水以保证湿度要求；待留兰香扦插苗生根后移栽并接种菌剂，每盆3株苗。接种所用菌剂摩西斗管囊霉购买于石河子大学绿洲农作物病害防控重点实验室，孢子密度为12～15个/g。

试验期间植株置于光照培养室中培养，光照强度约为8 000 lx，光照时间为14 h，黑暗处理时间10 h，培养温度(23±2) ℃，空气相对湿度50%～60%。植株生长期间根据栽培基质含水量情况定期定量浇水，避免幼苗受到干旱胁迫。栽培所用塑料花盆规格为盆口直径18 cm、盆底直径15 cm、高15 cm。栽培基质为草炭土与蛭石按体积比3∶1混合而成，使用前经121 ℃高温灭菌2 h。

1.2 试验设计

两种植物均设置0、50、100、150、200 mmol/L 共5个NaCl浓度梯度，每个梯度下又设置丛枝菌根(AM)真菌处理(接种与对照)，每种植物共组成10个组合处理，每个处理重复3盆，共30盆。AM真菌接种处理将30 g菌剂施于幼苗根系周围，保证菌剂与根系充分接触，对照处理施加等量灭菌菌剂。在接种AM真菌80 d后进行盐胁迫处理，每天每盆浇灌50 mL设计浓度的NaCl溶液。为防止盐分流失，花盆底部放置托盘，如有渗漏，将渗出液倒回盆中，胁迫处理共进行10 d。胁迫处理结束后测定各项指标。

1.3 测定指标与方法

分别选取两种植物粗细均匀的须根，将根系剪成约1 cm的根段并冲洗掉表面杂质，参考Phillips等[14]的方法测定菌根侵染率、侵染强度、丛枝丰度与泡囊丰度；用剪刀分别剪取不同盐浓度NaCl溶液处理的留兰香和常夏石竹植株中上部长势良好且较均匀的叶片，每份0.5 g，用锡纸包好并作标记后放入-80 ℃超低温冰箱中保存，以备各生理指标的测定；各项指标均重复测定3次。其中，总叶绿素含量的测定用乙醇提取法，可溶性糖含量用蒽酮法测定，可溶性蛋白含量用考马斯亮蓝G-250法，脯氨酸含量用酸性茚三酮法，超氧化物歧化酶(SOD)活性用氮蓝四唑法[15]测定；过氧化物酶(POD)活性用愈创木酚法，过氧化氢酶(CAT)活性用钼酸铵法，抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性用比色法，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法[16]测定。

1.4 数据分析

使用SPSS 23.0软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)及多重比较(Duncan)，差异显著性水平为0.05。使用OriginPro 8.0软件绘制柱状图。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对留兰香与常夏石竹AM真菌侵染特性的影响

在接种AM真菌并进行盐胁迫处理后，两种植物根系中均观察到了菌丝、丛枝和泡囊等侵染结构(图1，A-C)。由表1可知，随着胁迫盐浓度的升高，两种植物根系AM真菌的侵染率、侵染强度、丛枝丰度和泡囊丰度均逐渐下降，但常夏石竹的各项侵染指标总体上均高于相应的留兰香。其中，与未施加盐胁迫处理(0 mmol/L)相比，留兰香的侵染强度和丛枝丰度在150～200 mmol/L NaCl胁迫下分别显著降低69.27%～79.38%和67.50%～76.92%，其侵染率和泡囊丰度在100～200 mmol/L NaCl胁迫下分别显著下降了27.27%～54.55%和30.67%～91.84%。同时，与未受到盐胁迫处理相比，常夏石竹的侵染强度在50～200 mmol/L NaCl胁迫下显著降低了39.91%～84.56%，其侵染率和丛枝丰度在NaCl浓度等于或高于100 mmol/L时均显著下降，其泡囊丰度在150～200 mmol/L NaCl胁迫下显著降低了63.25%～71.20%。可见，盐胁迫对两种植物的AM真菌侵染特性均产生了一定程度的不良影响，且留兰香的侵染率和泡囊丰度更易受到影响，常夏石的竹侵染率、侵染强度和丛枝丰度更容易受到影响。

表1 盐胁迫对留兰香与常夏石竹AM真菌侵染特性的影响

2.2 盐胁迫下AM真菌对留兰香与常夏石竹总叶绿素及渗透调节物质含量的影响

表2显示，随着盐胁迫浓度的升高，不管是否接种AM真菌，留兰香和常夏石竹叶片的总叶绿素含量均持续下降，且留兰香的下降幅度大于常夏石竹；在200 mmol/L盐胁迫条件下，未接种留兰香和常夏石竹叶片的总叶绿素含量分别比未受盐胁迫处理(0 mmol/L)显著降低32.49%和11.38%，而接种植株叶片则分别显著降低33.40%和12.52%。在各相同浓度盐胁迫下，留兰香的总叶绿素含量在接种AM真菌后都得到显著提高，接种常夏石竹的总叶绿素含量也在除100 mmol/L以外的盐浓度处理下显著提高，并均在150 mmol/L盐胁迫下的提高幅度最大，此时留兰香和常夏石竹的增幅分别为16.33%和2.03%，留兰香的提高幅度明显高于常夏石竹。

表2 盐胁迫下AM真菌对留兰香与常夏石竹总叶绿素及渗透调节物质含量的影响

同时，不管是否进行接种处理，留兰香与常夏石竹叶片的可溶性糖、脯氨酸含量均随着盐胁迫浓度的升高而升高；例如，在200 mmol/L盐胁迫下，与未受胁迫处理相比，接种和未接种AM真菌常夏石竹叶片的可溶性糖含量分别显著提高了0.95倍和0.87倍，而其脯氨酸含量分别显著提高了1.41倍和2.01倍。与未接种AM真菌相比，接种AM真菌显著提高了100～200 mmol/L盐胁迫条件下留兰香的可溶性糖含量，其在150 mmol/L盐胁迫下增幅达到1.21倍；接种处理显著提高了各盐浓度条件下常夏石竹的可溶性糖含量，其在100 mmol/L盐胁迫下增幅达到35.56%。相反，两种植物叶片的脯氨酸含量在接种AM真菌后均比未接种处理显著降低，且均在200 mmol/L盐胁迫下下降幅度最大，此时接种留兰香和常夏石竹叶片脯氨酸含量分别比相应未接种处理降低27.16%和32.63%。

另外，随着胁迫盐浓度的升高，不管是否接种AM真菌，留兰香的可溶性蛋白含量均呈现先升高后降低的趋势，且均在150 mmol/L盐胁迫下达到最高；在各盐胁迫浓度下，接种处理均显著提高了留兰香叶片的可溶性蛋白含量。与留兰香表现不同，常夏石竹叶片的可溶性蛋白含量在不接种或接种处理时均随着盐胁迫浓度的升高而持续升高，且在各盐胁迫水平下接种AM真菌均能显著提高常夏石竹叶片的可溶性蛋白含量。

可见，盐胁迫显著降低了留兰香与常夏石竹叶片内叶绿素的含量，而显著促进了叶内渗透调节物质(可溶性糖、脯氨酸含量和可溶性蛋白)的积累；AM真菌可以提高盐胁迫下植物体内叶绿素的含量以及可溶性糖和可溶性蛋白，却同时降低脯氨酸的积累。

2.3 盐胁迫下AM真菌对留兰香与常夏石竹叶片抗氧化酶活性的影响

随着盐浓度的升高，不管是否接种AM真菌，留兰香叶片的抗氧化酶SOD、POD、CAT和APX活性均呈现先升高后降低的趋势，且各抗氧化酶的活性均在150 mmol/L盐浓度下表现最高；各抗氧化酶活性在接种AM真菌后均比未接种处理不同程度提高(图2)。其中，在相同盐胁迫浓度下，接种AM真菌留兰香叶片的SOD活性，除150 mmol/L盐胁迫处理外，均与未接种处理差异显著，并在100 mmol/L盐浓度时提高幅度最大(59.59%)(图2，A)；接种AM真菌留兰香叶片POD活性在各浓度盐胁迫时均比相应未接种处理显著提高，其在200 mmol/L盐胁迫下显著提高幅度达到59.74%(图2，B)；与未接种处理相比，接种AM真菌留兰香的叶片CAT和APX活性分别受到100～150 mmol/L和50～150 mmol/L盐胁迫时显著提高，且CAT和APX活性均在受到100 mmol/L盐胁迫时提高幅度最大，分别达到25.38%和56.24%(图2，C、D)。

不同小写字母代表不同处理间在0.05水平差异显著(P<0.05)；下同。图2 盐胁迫下AM真菌对留兰香叶片抗氧化酶活性的影响Different normal letters represent significant differences in different treatments at 0.05 level (P<0.05); The same as belowFig.2 Effects of AM fungi on antioxidant enzyme activities in leaves of M. spicata under salt stress

同时，随着盐浓度的升高，不管是否进行接种处理，常夏石竹叶片的SOD、POD、CAT与APX活性总体上均呈现不断升高的趋势，与其他抗氧化酶相比，常夏石竹的POD活性在200 mmol/L盐胁迫下与未受盐胁迫处理相比升高幅度最大；同样，与未接种处理相比较，接种AM真菌也使得各抗氧化酶活性不同程度提高(图3)。其中，接种AM真菌显著提高了除100 mmol/L盐浓度下常夏石竹叶片的SOD活性，且在150 mmol/L盐胁迫时提高幅度最大(图3，A)；接种AM真菌常夏石竹叶片的CAT活性在各浓度盐胁迫下均与未接种处理差异显著，且在未受到盐胁迫时，接种AM真菌对常夏石竹CAT活性的提高作用最显著，增幅达到67.18%(图3，C)；接种AM真菌使常夏石竹的POD活性在未受盐胁迫以及受到100～200 mmol/L盐胁迫时比未接种处理显著升高了19.26%～60.71%，且在200 mmol/L盐胁迫下增幅最大(图3，B)；与不进行接种处理相比，接种AM真菌仅使常夏石竹叶片的APX活性在未受盐胁迫处理时比未接种处理显著提高，其余浓度盐胁迫处理均提高效果并不显著(图3，D)。以上结果表明，各浓度盐胁迫会在不同程度上影响两种植物体内几种抗氧化酶的活性，干扰抗氧化酶系统的稳定性，而接种AM真菌可以有效改善盐胁迫对植物抗氧化酶系统的消极影响，缓解盐胁迫对植物造成的伤害，且植物间和抗氧化酶之间的反应敏感性不尽相同。

图3 盐胁迫下AM真菌对常夏石竹叶片抗氧化酶活性的影响Fig.3 Effects of AM fungi on antioxidant enzyme activities in leaves of D. plumarius under salt stress

2.4 盐胁迫下AM真菌对留兰香与常夏石竹叶片丙二醛含量的影响

随着盐浓度的升高，不管是否接种AM真菌，留兰香叶片中的丙二醛含量均先升高随后降低，并在150 mmol/L盐胁迫时达到最高(图4，A)；与留兰香表现不同，常夏石竹叶片中的丙二醛含量随着盐浓度的升高而不断升高，在200 mmol/L盐胁迫时达到最高(图4，B)。与未接种处理相比，接种AM真菌不同程度降低了各盐浓度条件下留兰香和常夏石竹叶片的丙二醛含量。其中，在相同盐浓度胁迫下，留兰香叶片的丙二醛含量在接种AM真菌后均比未接种处理显著降低，在100、200 mmol/L盐胁迫条件下降幅分别达到45.67%和42.96%；除150 mmol/L盐胁迫浓度外，常夏石竹叶片的丙二醛含量在接种AM真菌后也比未接种AM真菌处理显著降低，并在200 mmol/L盐胁迫下降低幅度最大，但其在各盐浓度下总体降低幅度均小于相应留兰香。以上结果说明接种AM真菌可以减少盐胁迫下两种植物体内丙二醛的积累，缓解盐胁迫对植物造成的过氧化损伤，有利于维持植物细胞膜系统的稳定性，且对留兰香的缓解效果更好一些。

图4 盐胁迫下AM真菌对留兰香(A)与常夏石竹(B)叶片丙二醛含量的影响Fig.4 Effects of AM fungi on malondialdehyde content in leaves of M. spicata(A) and D. plumarius(B) under salt stress

3 讨 论

根系侵染率是评价AM真菌与宿主之间是否存在共生关系的重要指标，侵染率越高，说明AM真菌与宿主的共生关系越好[17]，侵染强度则反映了AM真菌与宿主植物结合的密切程度。丛枝是菌丝侵入寄主植物根细胞后连续快速分枝形成的一种枝状结构[18]，是养分吸收和交换的重要场所[19]，泡囊是由宿主皮层细胞或细胞内菌丝末端或中部膨大而成的一种特殊结构。在逆境条件下，AM真菌不同侵染结构的形成会受到影响。王玉丹[20]研究了盐胁迫下鹅绒委陵菜根部AM真菌侵染特性，结果表明随着盐胁迫程度的加强，根系侵染率、丛枝丰度、泡囊丰度、侵染强度均有所降低；王英男等[21]研究发现，随着盐、碱胁迫强度的增加，AM 真菌对羊草的侵染率与侵染强度均呈下降趋势。与前人研究结果相似，本研究结果表明，随着盐浓度的升高，留兰香与常夏石竹的AM真菌侵染率、侵染强度、丛枝丰度和泡囊丰度均不断下降，这可能是由于盐胁迫影响了宿主植物对营养物质的吸收进而影响宿主与AM 真菌之间的物质交换。总体来看，常夏石竹的各项侵染指标均高于留兰香，这很可能与不同宿主植物AM 真菌侵染的机理不同有关[22]；另外，同一AM真菌对不同植物的亲和力也不同。

叶绿素作为植物光合作用的关键色素, 其含量的变化直接影响植株的光合能力[23]，而盐胁迫会抑制叶绿素合成过程中必需元素的吸收，降低叶片中叶绿素的含量[24]。Zhu等[25]研究发现，接种AM真菌显著增加了刺槐叶片的叶绿素含量。本研究结果显示，随着盐胁迫浓度的升高，不管是否接种AM真菌，留兰香和常夏石竹叶片的总叶绿素含量均持续下降，而接种AM真菌显著提高了各盐浓度下留兰香的总叶绿素含量。这可能是由于接种AM真菌能够在一定程度上缓解盐胁迫对叶绿素酶的伤害，从而减轻叶绿素的降解[26]。同时，可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸是维持植物细胞膜结构和功能的重要渗透调节物质[27]，积累这些渗透调节物质是在渗透胁迫下植物体维持渗透平衡的一种保护机制[28]。本研究结果表明，一方面，接种AM真菌显著提高了留兰香和常夏石竹叶片的可溶性糖及可溶性蛋白含量；另一方面，接种AM真菌显著降低了留兰香和常夏石竹在不同盐浓度条件下的脯氨酸含量。陈飞[8]研究了盐碱胁迫条件下接种AM真菌对星星草各项生理指标的影响，结果表明接种处理的星星草中可溶性蛋白含量明显高于未接种植株，同时AM真菌可以显著降低星星草叶片的脯氨酸含量，减轻盐分对星星草的毒害；张爱娣等[29]研究发现，接种 AM真菌可显著降低盐胁迫下大叶女贞叶片的脯氨酸含量，显著提升大叶女贞叶片的可溶性糖及可溶性蛋白含量，与本研究结果相一致。不同渗透调节物质含量的多少是植物受胁迫程度的一种反映，以上研究结果表明，在盐胁迫条件下，AM真菌可以在很大程度上降低盐分对植物的伤害，维持植物的正常生长。

植物可以在逆境胁迫下激活抗氧化系统，其中SOD、POD、CAT和APX是保护植物免受活性氧引起的氧化应激的重要酶[30]，盐胁迫下植物能提高抗氧化酶活性和抗氧化物质的含量以适应盐胁迫，保持体内正常的代谢活动[31]。本实验结果表明，随着盐浓度的升高，不管是否接种AM真菌，留兰香的SOD、POD、CAT和APX活性均呈现先升高后降低的趋势，且不同抗氧化酶的活性均在150 mmol/L盐浓度下表现最高，而常夏石竹的SOD、POD、CAT、APX活性均随着盐浓度的升高呈现不断升高的趋势，这一方面是由于不同植物的耐盐能力不同，另一方面可能是由于高浓度的盐胁迫对留兰香造成了严重伤害，导致酶活性降低。另外，接种AM真菌提高了留兰香和常夏石竹在盐胁迫条件下SOD、POD、CAT和APX的活性，减轻了氧化胁迫对植物造成的伤害，这与刘耀臣等[32]研究丛枝菌根真菌对盐胁迫下芹菜生长和生理指标的影响以及Wang等[33]研究接种AM真菌对盐胁迫条件下玉米叶片SOD、CAT和APX活性的影响结果相一致。上述研究结果表明，接种AM真菌能够提高植物抗氧化酶的活性，增强植物体内氧自由基的清除能力，从而降低氧化胁迫对植物造成的伤害[34]。

当植物遭受环境胁迫时，细胞膜首先受到损伤，导致膜脂过氧化，细胞内溶物外渗，并积累膜脂过氧化产物丙二醛[35]。丙二醛含量可以作为衡量体内自由基多少的标志，也是反映细胞膜脂过氧化作用强弱和质膜损伤程度的重要指标[36]，丙二醛含量越高，植物受到损伤程度越大。周昕南等[37]研究表明，接种AM真菌显著降低了向日葵叶片的丙二醛含量，提高了向日葵对盐胁迫的抵抗能力；Wang等[38]研究了AM真菌减轻盐胁迫对榉树叶和根影响的生理机制，结果表明接种AM真菌降低了榉树叶和根中的丙二醛含量。本试验结果显示，接种AM真菌降低了留兰香与常夏石竹叶片中的丙二醛含量，这与前人的研究结果相一致，表明接种AM真菌可以减轻细胞膜脂过氧化作用，维持膜系统的稳定性，从而提高植物的耐盐能力[39]。

综上所述，盐胁迫会对AM真菌的侵染特性以及留兰香和常夏石竹的生长产生不良影响。而接种AM真菌可以提高植物的总叶绿素含量，有利于调节植物体内渗透调节物质的含量、提高植物体内抗氧化酶的活性、降低盐胁迫对植物造成的过氧化损伤，从而在不同程度上缓解盐胁迫对留兰香和常夏石竹造成的伤害，有利于植物在盐胁迫条件下更好地生长。接种Glomusmosseae提高了留兰香和常夏石竹的耐盐能力，为两种植物在盐渍化土壤的推广种植提供理论依据。