固相萃取-超高效液质联用法检测4种农药对小麦中呕吐毒素的控制作用

张文文 殷锡峰 高英春 董科 罗玉婷

（1.镇江市农产品质量检验测试中心 江苏镇江 212009；2.镇江蔬菜研究所；3.句容市农产品质量安全监测中心）

1 前言

呕吐毒素（DON）又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇，是镰刀菌产生的单端孢霉毒素，属于真菌毒素的一种。人畜摄入过量呕吐毒素污染的食物，会出现中毒症状，严重者造血系统、免疫系统会受损，甚至死亡。因镰刀菌喜湿冷环境，而江苏4月—5月为多雨季节，利于其繁殖，使其代谢旺盛，若田间管理疏漏，治理不到位，容易出现大规模发病，导致小麦的呕吐毒素含量严重超标。

小麦赤霉病是小麦种植过程中出现的一种真菌病害，表现为粉红色霉状物，导致籽粒干瘪、营养价值下降，受侵染的小麦会产生有毒的次生代谢产物，最主要的是呕吐毒素[1]。韩建平等[2]研究发现赤霉病是不完善粒中影响DON的主要因素。吴本刚等[3]研究发现赤霉病粒与呕吐毒素二者呈显著的正相关关系。现阶段小麦呕吐毒素的检测方法主要是高效液相色谱法和酶联免疫法[4-6]，本文采用固相萃取-超高效液质质联用[7-9]，对生长期施用过4种农药的小麦进行检测，确定了一种准确、快捷的小麦呕吐毒素检测方法；同时分析4种农药对小麦呕吐毒素的控制作用，以期为小麦的生产管理提供参考。

2 材料与设备

2.1 试验品种、试剂及药品

镇麦12号；乙腈（默克）；甲醇（默克）；醋酸铵（国药）；呕吐毒素标准品（romer公司）；49%氰烯戊唑SC；20%咪丙WP；50%咪鲜胺WP；25%多酮WP。试剂均为农资店购买。

2.2 试验设备

液相色谱串联质谱仪（AB QTRAP 4500-Agilent 1290）；氮吹仪（TTL-DCII，北京同泰联科技发展有限公司）；冷冻离心机 （Centrifuge 5804R，德国Eppendorf公司）；振荡器（IKA HS 260）；固相萃取装置。

3 试验与方法

3.1 小麦田间试验

于2015—2016年在句容行香园区试验点种植镇麦12号，播种方式为撒播，常规栽培管理。在小麦扬花期施药2次，2016年4月18日施药1次，4月23日施药1次，共计5个处理，15个小区，小区面积为20 m2，均匀喷雾施药。2016年6月5日收获后，检测小麦呕吐毒素的含量。

3.2 前处理方法

3.2.1氨基柱净化法

称取小麦粉末5.00 g置于锥形瓶中，加入25 mL提取液（84%的乙腈水）；置于摇床上以180r/min震荡30 min，2 500 r/min离心5 min，取上清液备用。

将氨基柱置于固相萃取装置上，用2 mL甲醇活化后，加入2 mL上清液过柱；再用2 mL提取液洗脱2次，收集滤液；将收集到的滤液氮吹干后，用1 mL流动相（25%甲醇）重溶，上机待测。

3.2.2未净化法

取2.2.1所得上清液1 mL，氮吹干后，加入25%甲醇溶解，上机待测。

3.2.3空白基质溶液配置

根据需要配制不同质量浓度的基质匹配标准溶液。

3.2.4加标回收配置

称取小麦粉末5.00 g置于锥形瓶中，共6份，分别加入含有50、50、200、200、400、400μg/L的标准品25 mL，按照2.2.1方法处理净化后，上机检测。

3.3 检测条件

3.3.1HPLC条件

色谱柱：ThermoSyncronis C18（1.7μm，100×2.1 mm，waters公司）；柱温：40℃；进样量：2μL；流速：0.2 mL/min；梯度洗脱流动相：A：5 mmoL/L醋酸铵水，B：甲醇，梯度洗脱，梯度洗脱程序：0.01-1 min，75%A-30%A；1-3 min，30%-10%A；3-6 min，10%A；6-6.01 min，10%-75%A；6.01-10 min，75%A。

3.3.2MS/MS条件

离子化模式：电喷雾电离模式（ESI）；质谱扫描方式：多反应监测模式（MRM）。

离子源温度：500℃；驻留时间：100 ms；雾化气：50 psi；辅助气：50 psi；气帘气：35 psi；喷雾电压：5 500 V（ESI+）；碰撞室射出电压：6V（ESI+）。

表1 质谱参数表

4 结果与讨论

4.1 标准曲线绘制结果

分别配置浓度梯度为0、25、50、100、200、400、800μg/L的标准溶液，上机检测。线性方程为Y=809.6X，相关系数为0.996，符合检测要求，检测限为0.03 ng/mL，定量限为0.11 ng/mL。

4.2 不同前处理方法对DON检测结果的影响

国内外文献对真菌毒素的检测主要是采用免疫亲和柱、多功能净化柱等检测方法，对于采用固相萃取净化方法的报道较少。本试验采用氨基柱净化方法，对提取液进行净化。净化和未净化的质谱图见图1、2。从图中可知，未进化的DON检测结果质谱图未分开，而采用氨基柱净化后的质谱图，可明显消除杂峰，降低杂质效应干扰。由此可知，该处理方法质谱图杂峰少，结果准确，方法快捷。

图1 净化后的DON检测结果质谱图

图2 未净化的DON检测结果质谱图

4.3 DON加标回收检测结果

DON加标回收检测结果见表2，从表2中可知，加标400μg/L时，平均回收率为78.3%左右，加标200μg/L时，平均回收率为105%左右，加标50μg/L时，平均回收率为105%左右，均在检测回收率要求范围内。

表2 DON加标回收检测结果表

4.4 施加不同农药的小麦DON检测结果

施加不同农药的小麦DON检测结果见表3，由表3可知，施用49%氰烯戊唑、20%咪丙、50%咪鲜胺、25%多酮用于防治小麦赤霉病后，小麦中DON的检测结果分别是1.53 mg/kg、1.10 mg/kg、1.65 mg/kg、1.48 mg/kg，说明施用咪丙或多酮在防治小麦赤霉病的同时，还可有效降低小麦中呕吐毒素的含量，建议推广应用于小麦赤霉病的防治工作中。

表3 施加不同农药的小麦DON检测结果表

5 讨论

粮食安全关乎国计民生，江苏省小麦购销总量位居全国前列，在影响粮食安全问题中，真菌毒素的影响比较普遍，呕吐毒素最为突出。许多专家学者已验证小麦赤霉病对呕吐毒素有着正相关的影响[10-13]，当前各市主要是施用多酮、氰烯戊唑、咪丙等药剂来防治小麦赤霉病，且防治效果较好[14-16]。本研究以小麦为样品，建立了一种固相萃取-超高效液质质联用检测小麦呕吐毒素的方法，该检测方法质谱图杂峰少，结果准确，方法快捷。通过试验分析4种农药对小麦呕吐毒素的控制作用，发现施用咪丙或多酮可有效降低小麦中呕吐毒素的含量，可推广应用于小麦赤霉病的防治。