二甲亚砜对绵羊精液低温保存效果的影响

盛云，许静*

（1.江苏省盱眙县盱城街道综合服务中心江苏淮安 211700；2.江苏省盱眙县动物卫生监督所江苏淮安 211700）

二甲亚砜是一种极性溶剂，跟水分子有很强的结合力并且易溶于水，可以快速通过细胞膜，使细胞快速脱水，降低冷冻液凝固点，从而减少细胞内形成的冰晶[1,2]。抗冻保护剂是为了防止低温对细胞造成损伤如精子DNA 损伤而添加的一种物质，抗冻保护剂主要分为渗透性和非渗透性抗冻保护剂，如甘油、丙二醇和本试验中的DMSO 等渗透性抗冻保护剂，如卵黄、牛血清白蛋白和果糖等非渗透性抗冻保护剂[3-5]。甘油又称丙三醇，是最早在绵羊精液中使用的通透性很强的抗冻保护剂，其可以降低胞内溶质的浓度，同时可以进入精子内部，减缓脱水速度，防止精子的渗透性损伤和细胞蛋白质的变性，但过高浓度的甘油有一定的毒性作用，会导致精子结构的损伤和酶活性的降低[6,7]。卵黄是大分子非渗透性抗冻保护剂，其中含有的卵磷脂和低密度脂蛋白可以附着在精子表面，降低精子的冷休克，另外卵黄还可以调节渗透压和离子浓度，同时为精子的运动和代谢提供能量，因此卵黄可以提高精液的保存品质，但卵黄属于动物源性的抗冻保护剂，存在一定的不稳定性和疾病传播感染的风险[8-10]。因此为了避免动物源性抗冻保护剂和有毒害作用的甘油对精液的影响，本试验在稀释液中添加不同浓度的DMSO，通过采用CASA 检测精液低温保存期间的精子活率、活力、直线速率、曲线速率和路径速率等，探究了DMSO 在绵羊精液低温保存中的作用效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1）试验动物本试验所用精液采自于江苏绿森然有限公司提供的3 只健康湖羊，年龄为2 岁，湖羊膘情适宜，无任何疾病，体质健壮。

2）主要试剂与药品DMSO、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、果糖、柠檬酸、青霉素钠和硫酸链霉素。

1.2 试验设计

本试验采用含有0、0.5%、1%、2%和3%DMSO 的绵羊精液低温保存稀释液对绵羊精液进行4℃低温保存，每隔24h 轻轻翻动精液，防止精子沉淀聚积而产生损伤。在精液保存期间，每天采用CASA 对精子活率、活力、直线速率、曲线速率、路径速率、鞭打频率和摆动性进行检测，以评价不同浓度的DMSO 对绵羊精液低温保存的作用效果。

1.3 试验方法

1）稀释液配置使用电子天平准确称取15.35g 的Tris、8.2g 的柠檬酸、10.00g 的果糖、0.15g 的青霉素钠和0.35g 的硫酸链霉素，充分溶解于500.00mL 灭菌的超纯水，配置成基础稀释液。分别取100.00、99.50、99.00、98.00 和97.00mL 的基础稀释液，分别加入0、0.5、1、2 和3mL 的DMSO，配置成DMSO 浓度为0（对照组）、0.5%、1%、2%和3%的稀释液。

2）精液采集与稀释采用假阴道法采集公羊精液，采精结束后，将精液置于37℃保温杯，并在30min 内带回实验室。对精液品质进行常规检查，选取颜色、气味和射精量正常的精液镜检，选取精子活力80%以上、畸形率低于15%的精液进行混匀处理，采用预热的含有不同浓度DMSO 的稀释液进行稀释，然后用多层棉花包裹置于4℃冰箱。

1.4 数据统计分析

利用Excel 对试验数据进行整理，利用SPSS 软件对数据进行单因素方差分析，处理结果用“平均值±标准误”表示。每组设置有3 个重复，P＜0.05 表示差异显著，P＞0.05 表示差异不显著。

2 试验结果

2.1 在低温保存下不同浓度DMSO 对绵羊精子活率的影响

由表1 可知，添加不同浓度DMSO 的稀释液在对绵羊精液低温保存期间，在各时间段均能显著提高精子活率（P＜0.05）。各处理组的精子活率随着DMSO 浓度的提高呈现先上升后下降的趋势，并且2%添加量的精子活率最高。保存1、5 和8d 时，2%处理组的精子活率显著高于其它各组（P＜0.05）；保存2～4 和7d 时，2%、3%处理组的精子活率显著高于其它各组（P＜0.05），但2%和3%处理组的精子活率差异不显著；在保存6d 时，2%处理组的精子活率显著高于对照组、0.5%和1%处理组的精子活率（P＜0.05），但与3%处理组的精子活率差异不显著。

表1 在低温保存下不同浓度DMSO对绵羊精子活率的影响（单位：%）

2.2 在低温保存下不同浓度DMSO 对绵羊精子活力的影响

由表2 可知，添加不同浓度DMSO 的稀释液在对绵羊精液低温保存期间，在各时间段均能提高精子活力。各处理组的精子活力随着DMSO 浓度的提高呈现先上升后下降的趋势，并且2%添加量的精子活力最高。在保存1 和6d 时，1%、2%和3%处理组的精子活力显著高于对照组和0.5%处理组的精子活力（P＜0.05）；保存2 和5d 时，2%处理组显著高于对照组、0.5%和1%处理组的精子活力（P＜0.05），但与3%处理组的精子活力差异不显著；保存3～4d 时，2%和3%处理组的精子活力显著高于其它各组（P＜0.05），但2%和3%处理组的精子活力差异不显著；保存7～8d 时，2%处理组的精子活力显著高于其它各组（P＜0.05）。

表2 在低温保存下不同浓度DMSO对绵羊精子活力的影响（单位：%）

2.3 在低温保存下不同浓度DMSO 对绵羊精子运动性能的影响

结果见表3，保存2d 时，1%和3%处理组的直线速率显著高于对照组和2%处理组的直线速率（P＜0.05），但与0.5%处理组的直线速率差异不显著；保存4d 时，0.5%处理组的直线速率显著高于对照组和1%处理组的直线速率（P＜0.05），但与2%和3%处理组的直线速率差异不显著；保存5d 时，1%处理组的直线速率显著高于对照组、0.5%和2%处理组的直线速率（P＜0.05），但与3%处理组的直线速率差异不显著；保存6d 时，1%处理组的直线速率显著高于对照组和0.5%处理组的直线速率（P＜0.05），但与2%和3%处理组的直线速率差异不显著；保存7d 时，3%处理组的直线速率显著高于1%处理组的直线速率（P＜0.05），但与其它各组差异不显著。

表3 在低温保存下不同浓度DMSO对绵羊精子运动性能的影响

保存1d 时，2%处理组的精子直线速率、曲线速率、路径速率最高，但与其它各组差异不显著；保存2d 时，各处理组的曲线速率、路径速率均显著高于对照组（P＜0.05），但各处理组间差异不显著；保存3 和6d 时，2%处理组的曲线速率、路径速率最高，且显著高于对照组（P＜0.05），但与其它各组间差异不显著；保存4d 时，2%处理组的曲线速率显著高于对照组和0.5%处理组（P＜0.05），但与其它各组差异不显著；保存5d 时，1%和2%处理组的曲线速率、路径速率显著高于其它各组（P＜0.05），但1%和2%处理组间的差异不显著；保存7d 时，3%处理组的曲线速率、路径速率显著高于0.5%和1%处理组（P＜0.05），但与其它各组差异不显著。

保存4d 时，2%处理组的精子鞭打频率最高，但与其它各组差异不显著；保存5d 时，2%处理组的精子鞭打频率显著高于对照组（P＜0.05）；保存2、5～6 和8d 时，2%处理组的精子摆动性显著高于对照组（P＜0.05）。