湖羊乳房炎病原菌的分离鉴定及其耐药性分析

薛瑞林，高 强，李守湖，柳纪省，马友记,3*

(1.甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.兰州威特森生物科技有限公司，甘肃 兰州 730030；3.甘肃省肉羊繁育生物技术工程试验室，甘肃 民勤 733300)

随着我国养羊业逐步向集约化、规模化方向发展，养殖方式和养殖规模转变，羊群运动量减少，加之饲养管理方面的不足，乳房炎已经成为影响养羊业发展的重要因素。引发乳房炎的因素有很多，但归根结底是由病原微生物感染引起。在乳房炎诸多病原中，以细菌型感染最为常见。当细菌感染动物乳房时，泌乳细胞受到破坏，影响泌乳机能，导致产奶量减少，乳品质下降，甚至丧失泌乳机能，继而影响羔羊发育和健康，给养殖业造成重大损失。目前，临床上治疗和控制羊乳房炎主要依赖抗生素。但是，临床上抗生素的不合理使用导致细菌产生多重耐药性，在乳汁中常常伴有大量的药物残留，造成企业养殖成本大大增加，同时威胁着人类的健康。因此，及时准确的掌握养殖场乳房炎病原菌的种类和耐药性情况是治疗乳房炎的关键。

中草药作为一种传统的“天然药材”，因其副作用小、无毒无残留、不易产生耐药性而成为近年来治疗乳房炎的热门选择。并且中草药成分丰富，富含糖类、皂苷类、生物碱、挥发性物质和有机酸等多种免疫活性成分，不仅对疾病和病原微生物有抑制作用，还能增强动物生产力、免疫力和繁殖能力，具有良好的替抗潜力。本研究就使用复方中草药制剂，进行体外抑菌试验，探究该制剂对于乳房炎病原菌的抑菌效果，为该制剂在临床上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 观察绵羊乳房红肿、发热，触摸有硬块，以及乳汁有絮状或凝块等肉眼可见变化即可判定为患有临床乳房炎。选取10只患有临床乳房炎的湖羊，采集20份乳样，每份10 mL，置灭菌50 mL离心管中加盖密封，置于附有冰袋的采样箱内低温保存，送回试验室进行病原菌分离及鉴定。

1.1.2 试剂及设备 革兰氏染色试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；一次性无菌平皿(90 mm)，牛津杯 (6×8×10 mm)，购自北京博纳瑞生科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自QIAGEN公司；DNA Marker，Ex Taq酶，购自TaKaRa生物科技有限公司；DNA胶回收试剂盒，购自OMEGA公司；药敏试剂盒、哥伦比亚血平板培养基购于杭州天和微生物试剂有限公司；PCR引物合成及扩增产物测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成；复方中草药制剂由兰州威特森生物科技有限公司自主研发和提供；其他试剂均为国产分析纯产品。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离、纯化及培养 将采集的乳样先进行细菌富集，摇匀乳样，无菌条件下取适量乳样加到灭菌后的普通营养肉汤液体培养基中，37 ℃，220 rpm条件下，恒温摇床培养12 h，再将富集后的菌液分别划线接种于普通肉汤培养基和血平板上，37 ℃温箱孵育24 h，观察菌落的形态，挑取具有典型特征的菌落进行分离培养，直至获得单一病原菌。

1.2.2 病原菌的形态学和分子生物学鉴定 观察病原菌菌落形态，挑取典型纯培养物进行革兰氏染色、镜检，挑选镜检涂片无杂菌者，提取菌体DNA，以提取的DNA为模板，使用细菌16S rDNA通用引物进行扩增，上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，预期目的片段1 500 bp。将PCR扩增的基因产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，产物纯化后送往苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，测序结果在NCBI上进行BLAST比对，结合传统微生物鉴定法判定病原菌。

1.2.3 菌液和复方中草药制剂的制备 取纯化培养后的菌株划线于普通肉汤培养基上，37 ℃温箱培养12～16 h后，挑取单菌落接种于营养肉汤，37 ℃、200 rpm培养12 h，利用平板菌落计数法对三种菌进行计数，调整菌液的终浓度为10CFU/ mL，标记后备用。

复方中草药制剂主要成分为白头翁、板蓝根、柴胡、丹参、黄芪、当归。该药品经离心、过滤和浓缩的预处理，使得生药含量为1.0 g/mL。根据预试验结果，将试剂离心后上清液二倍稀释为500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL和15.625 mg/mL等6个浓度梯度的药液，121 ℃高压灭菌，标记后4 ℃保存备用。

1.2.4 耐药试验 参照邓海平的方法采用药敏纸片法进行抗生素的药敏试验，参照陈薇的方法采用牛津杯法进行复方中草药制剂的药敏试验。即吸取0.1 mL制备好的菌悬液，滴入事先准备好的经过高压灭菌的普通营养琼脂平板内，使用涂布器涂匀，再分别放置抗生素药敏纸片和牛津杯，牛津杯中加入0.2 mL制备好的不同浓度中草药制剂，每株分离菌设3个重复。37 ℃恒温培养18～24 h，观察试验结果，使用游标卡尺测量抑菌圈直径，结果取平均值。结果判定标准：抑菌圈直径小于10 mm为耐药(R)、10 mm～15 mm为中度敏感(I)、大于15mm为敏感(S)。

1.2.5 最小抑菌浓度(MIC)测定 复方中草药制剂对3种乳房炎病原菌MIC值的测定参考柯文杰等的方法进行：将稀释的复方中草药制剂按浓度大小依次分装至试管，每个试管2 mL。再往每个浓度梯度试管中分别加入100 μL菌液，每个样品做3个重复。同时每个梯度组设1支不含复方中草药制剂只含等量菌液的阳性对照管以及1支不含菌液只含复方中草药制剂的阴性对照管。37 ℃恒温培养16～18 h，肉眼观察无细菌生长时的最低药物浓度为该制剂的MIC值。

1.2.6 最小杀菌浓度(MBC)测定 MBC的测定参考聂鲡蓉等的方法进行：从每种细菌的MIC和高于MIC浓度的各试管中分别吸取100 μL培养物，接种于营养琼脂培养基，37 ℃恒温培养48 h，肉眼观察无菌落生长的最低浓度即为该制剂的MBC值。

2 结果与分析

2.1 细菌形态学鉴定

纯化后细菌在血平板上培养形成三种不同形态的菌落，分别命名为gs1、gs2、gs3。gs1在血平板上生长良好，形成灰白色、不透明、表面光滑、直径0.5～1 mm大小的圆形菌落。gs2在血平板可见灰白色、边缘整齐、表面光滑、半透明、小凸起的圆形菌落。gs3在血平板可见金黄色，凸起，表面光滑的圆形菌落，并可见溶血圈。放在油镜下观察，gs1为革兰氏阳性菌，菌体呈球状，多单个或成双排列；gs2显示为革兰氏阴性菌，菌体呈短杆状，两端呈钝圆形，短链很少出现；gs3为革兰氏阳性菌，菌体为球状，并可见葡萄串状排列(如图1所示)。

2.2 病原菌分子生物学鉴定

通过对菌组DNA进行PCR扩增，得到3条长度序列约为1 500 bp左右的PCR扩增产物，符合试验预期(如图2)。

PCR产物测序及BLAST比对结果显示结果显示，在分离得到的病原菌中，14株检出细菌的16S rDNA序列，分别与GenBank公开的金黄色葡萄球菌菌株NBRC 100910(登录号为NR113956.1)的16S rDNA序列有99%～100%同源，确定为金黄色葡萄球菌，占总分离菌株数的50%；10株检出细菌的16S rDNA序列，分别与大肠杆菌株E84-1(登录号为KJ477001.1)的16S rDNA序列有99%～100%同源，确定为大肠杆菌，占总分离菌株数的36%；另外4株则分别与粪肠球菌株NBRC 100490(登录号为NR113906.1)的16S rDNA序列有99%～100%同源，占总分离菌株数的14%。

图1 三种细菌在血平板上的菌落形态(左)及革兰氏染色镜检结果(右)Fig. 1 Colony morphology of three bacteria on blood plates (left) and Gram staining microscopy results (right)

图2 分离菌株凝胶电泳结果Fig. 2 Results of gel electrophoresis of isolated strains

2.3 耐药试验

2.3.1 抗生素耐药试验 抗生素药敏试验结果如表2所示。以上结果表明，3种病原菌对诺氟沙星、左氟沙星、氯霉素、庆大霉素及环丙沙星敏感性较好，对青霉素、红霉素和氨苄西林有较强的耐药性。

2.3.2 复方中草药制剂耐药试验 复方中草药制剂耐药试验结果如表3所示。结果显示，该中草药制剂能有效抑制3种乳房炎病原菌的生长，并且药物浓度相同的情况下，金黄色葡萄球菌抑菌圈直径普遍大于其余两种细菌。

2.3.3 MIC值和MBC值的测定 复方中草药制剂对粪肠球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌试验结果表明，该制剂对3种乳房炎病原菌的MIC依次分别为125 mg/mL、125 mg/mL和62.5 mg/mL，MBC分别为250 mg/mL、125 mg/mL和125 mg/mL。

表2 抗生素耐药试验结果Table 2 Antibiotic resistance test results

表3 复方中草药制剂耐药试验结果Table 3 Resistance test results of compound Chinese herbal medicine preparations

3 讨 论

3.1 病原菌分离鉴定

引发羊乳房炎的病原菌种类繁多，金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、化脓性棒状杆菌、芽孢杆菌、结核杆菌等都可以引发羊乳房炎。李强等曾对河南某湖羊养殖场乳房炎病原菌进行分离鉴定，得到葡萄球菌和大肠杆菌两种病原菌。本次试验分离结果与其基本一致，但本次试验还分离得到粪肠球菌。本次试验分离得到湖羊乳房炎主要病原菌种类与他人研究存在差异的原因可能是地理位置对于乳房炎病原菌分布的影响，亦或是养殖场环境、饲养管理方式以及当地气候的不同造成湖羊对于乳房炎病原菌易感性的变化。

3.2 抗生素耐药试验

药敏试验结果显示，本次试验分离得到3种病原菌对诺氟沙星、左氟沙星、氯霉素、庆大霉素及环丙沙星敏感性较好，并且金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对于诺氟沙星和左氟沙星的敏感性要强于粪肠球菌。但3种细菌均对青霉素、红霉素和氨苄西林有较强的耐药性。张明国等曾对四川攀西地区奶牛乳房炎病原菌进行分离鉴定和耐药性分析，得到大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、屎肠球菌等17种乳房炎病原菌，其中大部分病原菌对庆大霉素、左氧氟沙星和环丙沙星等药物敏感，对青霉素、甲氧苄氨嘧啶和氨苄西林等药物呈现较强耐药性。与本研究结果基本一致，所不同的是，本研究所得病原菌对红霉素耐药。乳房炎主要致病菌的药敏结果存在的差异可能是因为不同地区针对乳房炎的常用防治方法、用药习惯存在差异致使不同地区的病原菌的耐药性产生差异。病原菌耐药性的产生主要是因为在临床治疗时长期或大量反复使用该类抗生素，导致病原菌对其产生耐药性。因此，在生产中进行乳房炎防治时，应当尽量避免是长期使用单一抗生素，采用多种药物合用或轮流使用的方法。进行乳房炎治疗时若使用某类或某种药物发现病情并没有改善时应当及时停止该类药物的使用更换其他药物，避免病原菌耐药性的产生，并加强病原菌耐药情况的监控。

3.3 复方中草药耐药试验

本试验用菌株均从患临床型乳房炎湖羊乳中分离鉴定得到，其中金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均为常见的乳房炎高致病菌，而粪肠球菌也是常见的乳房炎病原菌，用复方中草药制剂对这3种病原菌做药敏测定，其结果对临床试验更具有参考意义。许多研究表明，中药及其提取物可以直接杀灭病原菌或通过多种途径提高机体免疫力达到防治疾病的效果。本研究就采用相比于醇提法操作更为简单、成本更为低廉的水提法提取白头翁、柴胡、黄芪、当归等6味中草药的有效成分，进行乳房炎病原菌的体外抑菌试验。结果显示，复方中草药制剂对引起湖羊乳房炎的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和粪肠球菌均有良好的抑杀作用，对金黄色葡萄球菌抑杀作用最强，本试验结果与金兰梅研究结果基本一致。本试验研究认为,该制剂对湖羊乳房炎主要致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和粪肠球菌均有很好的抑杀作用，对临床上使用中草药制剂防治湖羊乳房炎，筛选对乳房炎病原菌有良好抑杀作用的中草药物进行防治湖羊乳房炎的兽药研发具有一定的指导意义。

4 结 论

该养殖场临床乳房炎的主要病原菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及粪肠球菌，3种菌均对青霉素、红霉素、氨苄西林有较强耐药性，对诺氟沙星、左氟沙星、氯霉素、庆大霉素及环丙沙星敏感性较好。复方中草药制剂能有效抑杀3种病原菌。