植物精油调控反刍动物瘤胃发酵和甲烷排放的研究进展

董春晓，郭晓飞，李义海，杨 晶，王 娟，张金龙*，张效生*

(1. 天津市农业科学院 畜牧兽医研究所，天津 300381；2. 天津市畜禽健康养殖技术工程中心，天津 300381)

反刍动物瘤胃中的微生物可通过降解饲料养分产生挥发性脂肪酸，并合成微生物蛋白质，为动物机体活动提供能量和蛋白质，但同时也存在排放甲烷和氨的弊端。甲烷是地球大气中主要的温室气体之一，其导致全球气候变暖的潜势是CO的21倍(20年水平)。而反刍动物肠道排放甲烷不仅污染环境，且会造成饲料能量损失(损失8%～12%)，降低动物生产性能。同时，瘤胃微生物降解饲料蛋白质产生的氮超过80%通过粪便和尿液排出，这严重降低了反刍动物对蛋白质的利用率。因此，迫切需要通过某些措施来减少反刍动物甲烷排放量和氮排泄量，以降低畜牧业生产对环境的影响，并提高该产业发展的可持续性。在饲料中添加抗生素可调控反刍动物瘤胃微生物区系，降低瘤胃中的甲烷产量和能量损失。但抗生素药物残留和耐药菌株的出现，增加了其使用风险，使得植物提取物、益生菌和酵母等绿色添加剂成为研究热点。

近年来，大量评估植物提取物(皂苷、植物精油和单宁)生物活性的研究发现，它们具备调控瘤胃微生物发酵、提高饲料利用率、减少甲烷排放和氮排泄的能力。其中，植物精油可有效改善瘤胃发酵的几个重要方面，如减缓淀粉和蛋白质的降解、降低瘤胃内氮代谢和氮排放，同时抑制甲烷产生。有研究证实，植物精油可与微生物细胞膜相互作用，从而抑制某些革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长，改变瘤胃微生物区系，降低甲烷和氨氮排放，使瘤胃发酵模式向有利于动物生产的方向发展。 但植物精油对反刍动物瘤胃发酵和甲烷排放的影响并非完全一致，这与精油的化学组成、添加剂量以及试验对象的选择息息相关。本文综述了植物精油对反刍动物瘤胃发酵和甲烷排放的影响，旨在为今后将植物精油合理应用于反刍动物生产提供理论依据。

1 植物精油的化学成分及生物学功能

1.1 植物精油的主要化学成分

植物精油是一类植物次生代谢产生的复杂混合物，主要由醇、醛、酮、酯和醚等碳氢化合物组成。植物精油可分为萜类化合物(来源于甲羟戊酸和脱氧木糖途径)和苯丙素类化合物(来源于莽草酸途径)两大类。大多数植物精油属于萜类化合物，并且最具代表性的是单萜，其含量可高达90%，如柠檬油精、百里香酚、香芹酚、芳樟醇、香芹酮和乙酸香叶酯。而苯丙素类化合物并不是植物精油中普遍存在的物质，其仅在肉桂、丁香和茴香中大量存在，在大多数植物精油中，苯丙素类化合物的含量都低于萜类化合物。在自然界中，植物产生精油主要是为了抵御捕食者、寄生虫和疾病等环境压力。一些植物精油还可保护植物免受种间竞争，并能吸引昆虫参与它们的繁殖过程。

植物精油是亲脂性化合物，一般密度比水低，通常在植物的根、茎、叶、花、果实或树皮的特殊细胞或细胞群中产生。植物精油的化学成分可能受多种因素影响，如植物的种类和生长期，植物的生长环境(土壤的营养、温度和水分)以及精油的提取方法。植物精油的常见提取方法有水蒸气蒸馏法、微波辅助蒸馏法、有机浸提法、压榨法、超临界CO萃取法、超声波萃取法和无溶剂微波萃取法等，其中，水蒸气蒸馏法是植物精油工业生产中最常用的方法。

1.2 植物精油的主要生物学功能

研究表明，植物精油的亲脂性质使其具有增加微生物细胞渗透性的能力，这种能力可能会干扰一些必需依赖蛋白质或者酶的反应，如：电子传递、蛋白转运、磷酸化反应和ATP生成，甚至可能引起细胞质凝固和细胞裂解。有一些植物精油(醛类)还可通过与核酸和蛋白质反应，从而导致微生物失活。另有一些植物精油(酚类)，如香芹酚、丁香酚和百里香酚，可以与微生物细胞膜上的转运蛋白及微生物酶作用，产生较强的抗微生物能力。作为一类混合物，植物精油包含的不同化学成分间可能具有累加、拮抗或协同作用。目前，有关植物精油的研究多围绕百里香、牛至、丁香、肉桂、迷迭香、莳萝、桉树、大蒜和茴香开展。百里香精油和牛至精油主要由百里香酚和香芹酚等单萜类化合物组成，其结构中的羟基和移位的电子可以通过氢桥为主要活性位点与水作用，从而使其具有较强的抗微生物活性。另有研究表明，百里香酚和香芹酚可通过裂解细胞膜、释放脂多糖和增加细胞膜对ATP的渗透性，从而对革兰氏阴性菌表现抗菌活性。丁香精油的主要化学成分是丁香酚，丁香酚可与蛋白质结合，抑制酶活力，并可促使细胞裂解，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出广泛的抗菌活性。肉桂精油中亦含有丁香酚(8%)，但其主要化学成分为肉桂醛(75%)，肉桂醛中羰基的存在可破坏细胞膜的完整性、结合蛋白质、抑制微生物酶活力并消耗细胞ATP。迷迭香、莳萝和桉树等许多植物中均存在诸如1,8-桉树脑、α-蒎烯、香芹酮、γ-萜品烯和柠檬烯的单萜类化合物，它们的生物活性主要归因于烷基的存在。此类化合物可以影响微生物细胞的生长和能量代谢，但其抗菌性不及植物精油中的酚类和醛类化合物。大蒜精油中富含有机硫化合物，如大蒜素和二烯丙基一硫化物，这两种化合物是大蒜精油对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有较强抗菌活性的关键，该类有机硫化合物可与特定的膜蛋白作用，以致破坏细胞膜的完整性。茴香精油几乎完全由茴香脑组成，而有关茴香脑的作用机制知之甚少，其生物学活性可能与芳族环上的醚基密切相关。

2 植物精油对反刍动物瘤胃发酵和甲烷产量的影响

2.1 植物精油对瘤胃微生物的影响

瘤胃微生物在饲料发酵、甲烷产生和氮利用过程中起着关键性作用，其活性直接影响反刍动物的生产性能和健康状况。研究表明，植物精油对多种瘤胃微生物表现出抗菌活性，可以改变瘤胃微生物结构。Kim等研究发现，添加2 g·L混合植物精油，可显著提高瘤胃液中原虫、真菌、溶纤维丁酸弧菌和黄色瘤胃球菌的数量，但对普雷沃氏菌和产琥珀酸丝状杆菌无显著影响。而Patra和Yu测得，丁香精油、牛至精油和薄荷精油(1 g·L)均可显著降低瘤胃液中嗜淀粉瘤胃杆菌和栖瘤胃普雷沃氏菌的数量，并能显著降低瘤胃原虫的数量。Cobelis等同样发现，添加1.125 mL·L牛至精油显著降低了瘤胃液中古细菌、普雷沃氏菌及总菌数量。此外，植物精油可有效降低瘤胃液中产甲烷菌(古细菌)的数量，但同时也影响了白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌等纤维分解菌的丰度，且抑制了原虫的生长(表1)。这意味着植物精油可在降低反刍动物肠道甲烷产量方面发挥有利作用，且可能对饲粮纤维的消化利用产生不良影响。然而，事实证明，甲烷产量并不总是伴随古细菌丰度的降低而减少，因为影响产甲烷过程的因素是多方面的，且与产甲烷途径相关的基因在不同的产甲烷菌种中有不同的表达。比如，Agarwal等研究发现，添加0.33 μL·mL薄荷精油增加了瘤胃液中产甲烷菌的数量，但甲烷产量降低20%，挥发性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)产量未受影响。因此，深入了解产甲烷菌和其他瘤胃微生物种群(细菌、原虫和真菌)之间的关系将有助于改善瘤胃功能。另有一些研究指出，瘤胃内的高效产氨菌对植物精油表现出一定的敏感性。如Patra和Yu报道，栖瘤胃普雷沃氏菌、布氏普雷沃氏菌、嗜胺梭菌、斯氏梭菌和溶纤维丁酸弧菌均明显受植物精油的影响。Patra和Yu还通过微阵列分析发现，植物精油对瘤胃微生物群落组成的影响取决于所选精油的化学性质。具有酚类结构的化合物(如牛至精油)，相比其他植物精油，在减少厚壁菌门、梭菌纲和丁弧菌属的丰度方面表现出更强的抗菌活性。由此可见，植物精油在一定程度上可调控瘤胃微生物区系，但这种影响可能因植物精油的来源、化学组成和剂量的不同而存在较大差异。

表1 植物精油对瘤胃微生物的影响Table 1 Effects of essential oils on rumen microorganisms

2.2 植物精油浓度及瘤胃微生物适应性对挥发性脂肪酸产量的影响

研究表明，补充植物精油可提高反刍动物瘤胃内总挥发性脂肪酸(total volatile fatty acid, TVFA)的浓度。例如，在一项体内试验中，饲喂绵羊400 mg·kg混合植物精油可显著提高瘤胃内TVFA浓度，且未改变饲料中各养分的消化率。而另一项体内研究表明，饲喂绵羊混合植物精油(0.8 mL·d或1.6 mL·d)不影响瘤胃内TVFA浓度和VFA比例。这可能是由于反刍动物的饲粮组成不同，导致了混合植物精油对瘤胃内TVFA浓度的影响差异。如Benchaar等报道，当饲喂泌乳奶牛混合植物精油(750 mg·d)时，苜蓿青贮饲粮组奶牛瘤胃中TVFA的浓度趋于提高；而玉米青贮饲粮组奶牛瘤胃中TVFA的浓度趋于降低。大多数研究中，补充植物精油或其化学成分，将导致瘤胃液中TVFA浓度降低或者不变(表2)。且植物精油对VFA浓度的影响还可能与其添加剂量相关。比如，Blanch等通过体外发酵试验测得，低剂量(200 mg·L或300 mg·L)混合植物精油不影响瘤胃液中TVFA的浓度，而当精油添加剂量为400 mg·L时，则显著降低了瘤胃液中TVFA的浓度及乙酸比例，且显著提高了丙酸和丁酸的比例。Joch等也报道了类似的结果，只有混合植物精油添加量高达600 mg·L后方能显著降低瘤胃液中TVFA的浓度，同时显著提高丁酸比例。Wu等通过体外研究同样发现，柚皮精油添加量为0.8 mL/L时，不影响瘤胃液中TVFA的浓度；而当添加量增至1.6 mL/L时，瘤胃液中TVFA的浓度显著降低。此外，一些研究结果还表明，植物精油的抗菌活性可能会随着时间的推移而改变，从而影响了瘤胃内VFA的产量。如Soltan等报道，饲喂绵羊植物精油(400 mg·kg)的前两天显著提高了瘤胃内丁酸的含量，但显著降低了丙酸的含量；而从第三天开始，丁酸含量下降，丙酸含量则得以显著提高，由此可见，参与丙酸生成的微生物似乎比产生丁酸的微生物对植物精油有更高的耐受性。Poudel等的研究也证实了，参与丙酸生成的栖瘤胃普雷沃氏菌能够在植物精油浓度逐渐升高的环境中生长。综上所述，低剂量植物精油似乎未能改变瘤胃中VFA的产量，而若增加植物精油剂量，瘤胃微生物亦能随着时间的推移适应植物精油的存在，因此认为植物精油只能在短期内影响VFA产量。

表2 植物精油对瘤胃发酵参数的影响Table 2 Effects of essential oils on rumen fermentation parameters

2.3 植物精油对瘤胃氮代谢的影响

在瘤胃中，绝大多数的饲粮粗蛋白质被微生物降解为氨，这是瘤胃微生物的主要氮源，有时甚至是唯一的氮源。而氨在瘤胃的产生速度远超于微生物的利用速度，因此，过量的瘤胃蛋白质水解和脱氨作用会导致反刍动物吸收过多的氨，这些氨被转化为尿素，随后主要通过尿液排出，从而造成环境污染增加。在生产中，可以通过添加影响瘤胃氮代谢的饲料添加剂，来减少反刍家畜的氮排泄。许多研究表明，添加植物精油能够抑制瘤胃中的蛋白质水解，且其对瘤胃中的高产氨菌、嗜淀粉瘤胃杆菌和普雷沃氏菌具有选择性抑制作用，这种抑菌能力可导致瘤胃氨产量显著下降。已有许多研究显示了植物精油缓解氨排放的能力(表2)。Cobellis等也发现，在体外发酵液中添加不同剂量牛至精油或迷迭香精油(1.0、1.5和2.0 g·L)，均可显著降低氨的产量(59%～78%)。此外，Hani和Adibe指出，在体外发酵液中添加90 μg·g广藿香精油，显著降低了发酵液中NH-N浓度。Wu等通过向瘘管湖羊瘤胃中添加0.8mL·L柑橘精油也发现，湖羊瘤胃液中NH-N浓度显著降低。李艳玲等的研究结果表明，在体外发酵液中添加低剂量茴香脑或百里香酚(50、100和200 mg·L)，对体外发酵液中NH-N浓度无显著影响；但当精油添加量为400 mg·L时，均可显著降低体外发酵液中NH-N浓度。而Soltan等研究发现，无论饲喂绵羊低剂量(200 mg·kg)商业混合植物精油，还是饲喂高剂量(400 mg·kg)均不影响瘤胃液中NH-N浓度。在另一些体内研究中也发现，瘤胃蛋白质代谢很少或者并未受到植物精油的干预，这可能是由于瘤胃微生物对植物精油的良好适应所致。此外，一些研究表明，植物精油对氮代谢的影响随其化学成分的不同而存在差异，通常含有酚化合物的精油具有更高的抗菌活性。由此可见，不同研究结果因植物精油的化学成分、剂量和试验方法的差别而异。因此，有必要进一步探讨植物精油在体内试验中对瘤胃氮代谢和微生物影响的系统知识，为合理运用植物精油调控瘤胃氮代谢，提高反刍动物的氮利用率提供理论依据。

2.4 植物精油对瘤胃甲烷产量的影响

甲烷是一种主要的温室气体，它在大气中的排放与畜牧业，尤其是反刍动物的生产直接相关。研究表明，植物精油具有较强的抗菌活性，可抑制大多数微生物，特别是细菌的生长和存活。一些植物精油可直接抑制产甲烷古细菌的生长，进而抑制甲烷产生，还可通过抑制某些有助于产甲烷的微生物代谢过程而间接减少甲烷的产量。此外，植物精油也可能通过减少与古细菌共生的某些原生动物的丰度，进而减少甲烷排放。基于这种对特定瘤胃微生物群落的选择性抑制作用，各类植物精油已被用于减少反刍动物肠道甲烷排放。大量的体外研究表明，植物精油具有抑制甲烷排放和调控瘤胃发酵的功效(表2)。周瑞等通过体外研究同样发现，瘤胃液发酵12、24和36 h时的甲烷产量，均随牛至精油添加量的增加(100、400、700和1 000 mg·L)而线性下降。金恩望等也指出，在体外发酵液中添加茶树油、肉桂油和丁香油均可降低甲烷体积分数，且当各精油添加量超过300 mg·L时，甲烷体积分数降低效果更显著。Macheboeuf等报道，当植物精油添加量同为5 mM时，肉桂精油和牛至精油可减少98%的甲烷产量，而茴香精油只能抑制12%的甲烷产量。Patra和Yu测试了五种不同植物精油(丁香、桉树、大蒜、牛至和薄荷)，得出添加量为1 g·L各处理甲烷产量均明显减少，其中牛至精油和大蒜精油处理甲烷减少量最高。但是，也有部分结果表明，植物精油的抗产甲烷活性是非特异性的，其抑制甲烷排放的过程伴随着饲料消化率的降低。这些不良影响的程度取决于所使用植物精油的成分和剂量以及所使用的发酵底物。目前，关于植物精油在反刍动物体内作用的研究较少。并且，大多数情况下，由于植物精油化学成分、动物日粮结构和饲喂方式的不同，体内研究往往显示出矛盾的结果，这也为确定瘤胃中达到有效植物精油浓度所需添加的剂量增加难度。Soltan等和Klop等报道，给绵羊和奶牛饲喂混合植物精油(400 mg·kg；0.17 g·kg)，可显著降低其甲烷产量。而Alemu等和Olijhoek等指出，给肉牛和奶牛补饲植物精油，并不能抑制甲烷排放。综上所述，在体外研究中，植物精油可有效抑制甲烷排放。未来需通过进一步研究来系统评价植物精油在反刍动物体内的应用，以确定植物精油可在生产中使用的有效作用浓度。

3 小 结

大多数植物精油或其活性成分在高剂量测试中抑制了瘤胃微生物的发酵，这证实了植物精油具有一定的抗菌活性。在多数情况下，当体外发酵试验中植物精油活性成分的浓度增加到500 mg·L以上时，其对微生物发酵的影响是有害的；在中等剂量下(50～500 mg·L)，一些精油能够通过改变VFA的产生和蛋白质代谢来改变瘤胃发酵。通常，由于补充了植物精油或其活性成分，可观察到乙酸丙酸比降低和丁酸浓度增加，以及甲烷产量的降低。而在蛋白质代谢方面，植物精油的作用机制可能与抑制脱氨作用有关。诚然，植物精油具有开发为瘤胃微生物发酵改良剂的潜力。但是，要将植物精油广泛用于生产实践中，仍存在许多困难。首先，植物精油的组成取决于许多因素，包括植物的种类、生长环境和生长阶段、用于精油的植物部位以及提取方法；而目前，任何植物精油产品都没有关于成分、结构和纯度的标准，从而妨碍了对不同试验中植物精油效果的了解，并阻碍了对所需植物精油的类型和剂量的确定。因此，今后的研究应详细报道植物精油的来源、提取方法、化学成分、纯度和使用剂量。其次，植物精油的化学稳定性较低，暴露于光、氧气和高温环境中会加速转化和降解，从而导致植物精油的质量、性能和抗菌活性损失或改变，因此，植物精油需妥善保存，以避免影响影响其功效。最后，迫切需要进行体内研究，以确定植物精油的最佳剂量，并确定瘤胃微生物对植物精油的适应性，以及评估动物产品中的植物精油残留问题，为安全有效的利用植物精油提供理论基础。