五味子乙素对铝中毒大鼠学习记忆及突触相关蛋白表达影响的研究

(右江民族医学院基础医学院，广西 百色 533000)

铝元素是常见的慢性蓄积性神经毒物，其广泛存在于自然环境中，通过多种途径侵入人体并损伤人体器官，其中最严重的是神经系统，并且铝中毒与多种退行性疾病的发生和发展有关。长期与铝接触，可引起机体学习记忆减退、认知功能状态出现异常等症状。与突触可塑性密切相关的主要蛋白有突触素(synaptophysin，SYN)、突触后致密蛋白-95(postsynaptic density protein-95，PSD-95)，它们表达异常可导致认知功能障碍及学习与记忆的减退[1-2]。研究表明五味子乙素(Schisandrin B， Sch B)具备保护大脑，改善记忆的功效[3]，但其作用机制尚未完全清楚。本研究旨通过用Sch B干预慢性铝中毒大鼠后，探索Sch B对铝中毒海马组织和大脑皮层中突触相关蛋白的表达及认知功能的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 购买于长沙天勤生物技术有限公司60只成年清洁级Wistar大鼠，雌雄各半，体重180～200 g，许可证号：SCXK(湘)2019-0014。研究经右江民族医学院实验动物伦理委员会批准(IACUC2020061101)后在学校实验动物中心[SYXK(桂)2017-0004]实施。

1.2主要试剂与药品 Sch B购买于维克奇生物科技公司(批号：wkq20060411)；吡拉西坦购买于广东华南药业集团有限公司(批号：国药准字H44020779)；PSD-95和Synaptophysin抗体购买于Proteintech中国公司；三氯化铝(AlCl3·6H2O)购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司(批号：L1706080)。

1.3实验方法

1.3.1慢性铝中毒模型建立和动物分组 按参考文献[4-5]造模方法，配制AlCl3浓度为16 g/L的水溶液，根据大鼠每天体重及食取饲料量，用AlCl3水溶液每天按120 mg/kg剂量拌入饲料中喂养大鼠，每天确保染铝饲料喂完后再进行普通饲料喂养，保证铝的摄入，连续染铝饲料喂养3个月，建立慢性铝中毒动物模型。将建模成功的大鼠随机分为5个组，即铝中毒模型组(n=10只) 、阳性对照组(n=10只)、Sch B 低剂量组(n=10只) 、Sch B 中剂量组(n=10只) 、Sch B 高剂量组(n=10只) 。阳性对照组用吡拉西坦按40 mg/kg剂量灌胃给药， Sch B低剂量组、中剂量组、高剂量组用Sch B分别按10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg的剂量进行灌胃，吡拉西坦和Sch B均每天给药1次，连续给药30 d；另10只大鼠作为空白对照组。

1.3.2Morris水迷宫记录描绘动物找到平台的游泳路径轨迹[5]对大鼠进行定位航行实验，在各象限内将大鼠面向池壁放入水中，大鼠找到平台后继续进行下一个象限训练，共训练4 d，电脑采集、记录描绘大鼠找到平台的游泳路径轨迹。

1.3.3免疫组化检测海马组织及大脑皮层中SYN、PSD-95表达 分别取海马组织和大脑皮层，经过固定、脱水及孵育一抗、生物素标记二抗，DAB显色后在显微镜下观察SYN和PSD-95阳性细胞表达。采用Image J软件对阳性细胞进行图像分析，测定其表达的平均光密度值(OD值)。

1.3.4Western Blot检测SYN、PSD-95在海马组织及大脑皮层的表达水平 分别提取海马组织、大脑皮层中的蛋白，用10% SDS-PAGE分离蛋白质，转膜，分别加一抗、二抗，ECL发光溶液进行曝光成像，采用Image J软件对蛋白带进行分析，计算SYN、PSD-95蛋白相对表达量。

2 结果

2.1Morris水迷宫定位航行实验记录大鼠找到平台的游泳路径轨迹 从各组大鼠定位航行实验游泳路径轨迹图看出，铝中毒模型组大鼠运动轨迹趋向性较差，在目标象限运动轨迹也明显减少，偏离平台，找到平台的时间明显增长。与铝中毒模型组比较，各Sch B实验组运动轨迹更多趋向于目标平台，在目标象限运动轨迹明显增多，找到平台的时间明显缩短(见图1)。

A：空白对照组，B：铝中毒模型组，C：阳性对照组，

2.2大鼠海马组织和大脑皮层SYN 、PSD-95蛋白结果 大鼠海马CA1和大脑皮层区可见SYN 、PSD-95呈棕黄色的阳性细胞；与空白对照组相比，铝中毒模型组SYN 、PSD-95阳性细胞表达较少；Sch B低、中、高剂量实验组阳性细胞表达比模型组的相对较多(见图2、图3)。空白对照组、铝中毒模型组、阳性对照组和Sch B低、中、高剂量实验组海马组织中SYN表达水平(光密度值，OD值)分别为15.33±1.40，9.56±1.28，13.26±1.71和10.42±1.30，11.94±1.96，13.16±1.09； PSD-95表达水平(OD值)分别为17.21±1.20，9.39±2.58，15.89±1.33和9.72±1.76，14.35±1.93，15.10±2.41。大脑皮层中SYN表达水平(OD值)分别为16.79±2.01，10.19±0.96，16.12±1.70和10.76±1.41，13.95±2.56，15.89±1.56； PSD-95表达水平(OD值)分别为21.02±0.97，14.26±0.70，17.84±0.44和15.23±0.74，15.76±2.44，18.36±0.87。铝中毒模型组的上述指标均较空白对照组明显降低，阳性对照组的上述指标均较铝中毒模型组明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；Sch B中剂量、高剂量实验组海马组织和大脑皮层中的SYN表达水平比铝中毒模型组明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；Sch B高剂量组海马组织和大脑皮层中的PSD-95表达水平比铝中毒模型组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

A：空白对照组，B：铝中毒模型组，C：阳性对照组，

A：空白对照组，B：铝中毒模型组，C：阳性对照组，

2.3Western Blot检测SYN、PSD-95在海马组织及大脑皮层的表达水平 空白对照组、铝中毒模型组、阳性对照组和Sch B低、中、高剂量实验组海马组织中的SYN蛋白相对表达量分别为1.22±0.23，0.12±0.03，1.29±0.34和0.55±0.20，0.63±0.20，0.97±0.19；PSD-95蛋白相对表达量分别为1.03±0.24，0.57±0.06，0.94±0.21和0.63±0.08，0.69±0.10，0.95±0.14；大脑皮层中的SYN蛋白相对表达量分别为1.25±0.18，0.68±0.11，1.16±0.07和0.76±0.06，0.99±0.12，1.08±0.13；PSD-95蛋白相对表达量分别为0.94±0.35，0.39±0.12，0.79±0.14和0.40±0.07，0.58±0.11，0.65±0.22。铝中毒模型组的上述指标均较空白对照组明显减少，阳性对照组的上述指标均较铝中毒模型组明显增多，差异均有统计学意义(P<0.01)；Sch B中、高剂量组海马组织和大脑皮层中的SYN蛋白相对表达量比铝中毒模型组明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；Sch B高剂量组海马组织和大脑皮层中的PSD-95蛋白相对表达量比铝中毒模型组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见图4、图5。

3 讨论

铝是一种人体非必需元素，长期过多的铝进入体内后会在肝、脑等组织中蓄积，对机体有毒性作用，可引起学习记忆功能减退、认知功能障碍等症状[6-7]。

A：空白对照组；B：铝中毒模型组；C：阳性对照组； D：Sch B

A：空白对照组；B：铝中毒模型组；C：阳性对照组； D：Sch B

Sch B是从五味子中提取的含量最高的木脂素，其具有许多生物活性，包括抗氧化、抗炎症和神经保护作用，改善学习记忆的能力，五味子提取物对认知功能有积极影响[8-10]。本研究Morris水迷宫定位航行训练结果显示，铝中毒模型组大鼠的潜伏期比空白对照组明显增长，说明慢性铝中毒可导致大鼠学习记忆能力下降，与文献报道的研究结果一致[11]。给予Sch B干预治疗后，Sch B中、高剂量组大鼠潜伏期缩短，尤以Sch B高剂量组潜伏期缩短明显，这表明Sch B可以改善铝中毒所引起的学习和记忆障碍，提高学习和记忆能力。

PSD-95和SYN是与突触可塑性密切相关的重要蛋白，它们能影响突触的结构和功能，SYN是突触的可塑性的基础[12-13]，PSD-95参与长时程突触传递增强，其表达水平与突触可塑性紧密相关[14-15]。故本研究检测海马组织和大脑皮层中SYN、PSD-95的表达情况来观察铝中毒学习记忆障碍是否与突触相关蛋白有联系。本研究结果发现，慢性铝中毒大鼠海马组织和大脑皮层中的SYN、PSD-95蛋白表达较空白对照组明显减少，给予Sch B干预1个月后，Sch B中、高剂量实验组中的SYN、PSD-95蛋白表达逐渐增多，尤其以Sch B高剂量实验组蛋白表达增多明显。提示Sch B可能通过调节与突触结构及功能相关的蛋白质表达水平，提高突触可塑相关蛋白SYN、PSD-95在海马组织和大脑皮层中表达水平，进而调节突触的可塑性，最终提高铝中毒大鼠学习记忆能力。

综上所述，慢性铝中毒引起学习记忆障碍与PSD-95、SYN蛋白在海马组织及大脑皮层中表达下降有关，Sch B能提高铝中毒大鼠的学习和记忆能力，这与海马组织和大脑皮层中的PSD-95、SYN蛋白表达增多有关。