小金钗春石斛原球茎增殖及试管苗移栽条件的优化

钟春水, 徐小萍, 林玉玲, 赖钟雄

(1.福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建 福州 350002；2.万源生态股份有限公司，浙江 台州 317523)

春石斛(Dendrobiumnobile)是兰科石斛属花卉，因自然花期常在春季而得名，其花大、香、艳而繁，多作盆栽生产，具有较高的观赏价值[1]。目前春石斛主要采用切芽、扦插和组培三种方法进行繁殖[2]。前两种方法繁殖系数低，而通过优化组培培养条件，可以提高春石斛原球茎增殖系数，从而提高春石斛工厂化生产效率。2003年毛碧增等[3]首次建立了春石斛不定芽离体再生体系，认为6-BA主要参与春石斛不定芽诱导，亚精胺对其增殖与壮苗有促进作用。王华等[4-5]研究了灭菌方法、激素种类及浓度配比等因素对春石斛组培快繁体系中丛生芽增殖、壮苗生根和炼苗移栽等方面的影响。Nambiar et al[6]研究表明，椰汁和葡萄糖更适于春石斛原球茎增殖生长；而仇硕等[7]研究表明，报春石斛丛生芽诱导与原球茎增殖以香蕉泥更佳，可见原球茎的最佳增殖条件因品种而异。廖飞雄等[8]研究表明，液体和固体培养基交替继代能使原球茎生长同步性好、增殖系数大。光周期和植物生长调节剂能够调控春石斛开花和营养繁殖[9-10]。已有学者分别对春石斛再生体系和离体培养条件进行优化[11-13]，并采用Solexa测序技术对春石斛离体培养过程中miRNA进行测序，发现miR156家族通过调控其靶基因来促进春石斛从营养生长到生殖生长的转变[14]。孟金玲[15]对春石斛试管苗移栽进行了研究。

本试验选用‘玫瑰红’大花品种的春石斛，又名小金钗、美花石斛(以下简称小金钗春石斛)，在我国产于广东、海南、广西、云南和贵州等地，观赏价值高。小金钗春石斛一般生于海拔400～1 500 m的树上和林下岩石上，不易获得且产量受限。关于小金钗春石斛组培快繁体系的建立及试管苗移栽尚未见相关报道。因此，本试验筛选了小金钗春石斛原球茎增殖的最佳培养基组分，并优化其试管苗移栽条件，以期为提高小金钗春石斛工厂化生产效率提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料由福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供，来源于小金钗春石斛叶片诱导并长期离体保存。植物生长调节剂为6-BA、IBA，有机添加物为椰汁。多菌灵(50%可湿性粉剂)由安徽省无为县腐殖酸厂生产，六针加密黑色遮阳网购自欧凡诚品淘宝店。

1.2 试验方法

1.2.1 6-BA、IBA和椰汁对原球茎增殖的影响 在吴高杰[14]的试验基础上，采用L9(34)正交试验设计，进一步优化小金钗春石斛原球茎增殖培养基组分。以不同浓度的生长调节剂和椰汁组合成9个处理进行正交试验，其中6-BA分别为1.25、1.50、1.75 mg·L-1；IBA分别为0.25、0.50、0.75 mg·L-1；椰汁分别为75、100、125 mL·L-1。以Knudson C (KC)为基本培养基，添加20 g·L-1白糖、5.5 g·L-1琼脂，pH为5.6，培养60 d，每种处理每瓶接10簇原球茎。参考并优化李璐[16]的方法,对小金钗春石斛原球茎增殖情况进行统计分析。对处理后的原球茎分化程度、颜色、紧实程度和增殖系数等性状进行打分，满分10分。根据各性状的重要性赋予一定的权重，其中原球茎分化程度按10簇中有x1簇分化赋值，得分为10-x1，权重占20%；原球茎增殖系数=(培养后鲜重-培养前鲜重)/培养前鲜重，按x2赋值，x2<7得分为(10·x2)/7，x2≥7则得10分，权重占50%；原球茎颜色按“白色”到“墨绿”分为10个等级，以等级(x3)进行赋值，得分为x3，权重占15%；原球茎紧实程度按“松散”到“紧得发硬”分为10个等级，以等级(x4)进行赋值，得分为x4，权重占15%。每个处理3个生物学重复。

1.2.2 试管苗移栽条件的筛选 采用三因素两水平L4(23)完全随机试验，探讨是否遮光、是否消毒和苗大小两两组合对小金钗春石斛移栽效果的影响。(1)苗大小处理。试管苗移栽前先炼苗1周。炼苗后将试管苗移出并洗净附着的培养基，按照2～3 cm和5～6 cm分为“小”和“大”两组，置于没有阳光直射的场所1 d。在移栽初期通过喷雾补充植株的水分，1周后正常养护，并在穴盘的每个穴里放8粒控释肥。(2)消毒处理。分别将不同大小的试管苗一半数量置于1%多菌灵药液中浸泡10 min，另一半置于水中浸泡10 min。(3)遮光处理。分别将在水草基质中种植的试管苗一半数量置于全光照条件下培养，另一半置于遮阳网下培养。移栽60 d后，统计各处理试管苗的株高、长势和存活率。根据各性状的重要性赋予一定的权重并打分，满分10分。株高按y1进行赋值，y1<8 cm得分为(y1/8)×10，y1≥8 cm则得10分，权重占30%；长势按叶片颜色偏淡绿且较软和叶片颜色偏绿且较硬进行赋值，得分分别为5和10，权重占30%；成活率按y2进行赋值，得分为10·y2，权重占40%。每个处理3个生物学重复。移栽培养60 d期间，光照强度约为2 500 lx、光照时间为12 h·d-1,培养温度为(25±2) ℃。

1.2.3 数据分析 采用SPSS 19.0对原球茎增殖系数和试管苗移栽因素进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 6-BA、IBA和椰汁对小金钗春石斛原球茎增殖的影响

2.1.1 适宜培养基的筛选 9种处理下的小金钗春石斛原球茎增殖性状综合得分见表1。Z4与Z8处理的原球茎得分较低(表1)，颜色较淡(图1D、1H)；在Z9培养基上培养的原球茎虽然增殖系数较大且颜色浓绿，但质地松散且分化严重(图1I)；在Z6培养基上培养的原球茎综合评分较高，且紧实程度高，分化程度很低(图1F)。综合表1和图1可知，长期离体培养的原球茎最佳增殖培养基为Z6。即：KC+1.5 mg·L-16-BA+0.75 mg·L-1IBA+100 mL·L-1椰汁+20 g·L-1白糖+5.5 g·L-1琼脂，pH值为5.6。

表1 小金钗春石斛原球茎增殖性状的综合评分Table 1 Comprehensive evaluation of characteristics of D.nobile protocorm-like bodies during proliferation

A～I分别表示在Z1～Z9培养基中增殖的小金钗春石斛原球茎。图1 9种处理下小金钗春石斛原球茎的增殖形态Figure 1 Morphology of protocorm-like bodies of D.nobile during proliferation under 9 treatments

2.1.2 6-BA、IBA和椰汁对原球茎增殖的影响 采用SPSS 19.0分析6-BA、IBA和椰汁交互作用对原球茎增殖的影响。主体间效应检验的F值见表2。在95%置信度下，6-BA对原球茎增殖的显著性水平Sig.<0.05，说明具有显著影响；IBA与椰汁对原球茎增殖的显著性水平均为Sig.>0.05，不存在显著差异(表2)。影响小金钗春石斛原球茎增殖效果的主次顺序为：6-BA>IBA>椰汁。采用Dunnett法进行处理间两两比较表明，Z1与Z6之间存在显著差异、Z1与Z7之间存在显著差异，其他处理间差异不显著。说明Z1与Z6或Z7之间的因素水平组合差异对试验结果有很大影响，均值最高的处理为Z6，综合评分高达8.30。因此，本试验仅6-BA对小金钗春石斛原球茎长期离体增殖培养有显著影响，且影响增殖效果的主次顺序为：6-BA>IBA>椰汁。

表2 影响小金钗春石斛原球茎增殖各因素主体间效应的检验Table 2 Inter-subject validation on factors affecting proliferation of D.nobile protocorm-like bodies

2.2 小金钗春石斛试管苗移栽条件的筛选

在原球茎增殖培养最佳培养基组合的基础上，进一步对试管苗进行移栽条件筛选。对移栽培养60 d的小金钗春石斛试管苗各项指标的综合评分见表3，移栽后的试管苗植株大小见图2，各水平显著性差异分析见表4。结果显示，光照、消毒、苗大小对移栽效果的影响依次为：苗大小>消毒>遮光，均达极显著水平，且这3个因素在95%置信度下主体间效应的检验Sig.=0.000，两两之间不存在交互作用，说明三者之间不会相互影响。从图2可见，用遮阳网遮光培养的小金钗春石斛试管苗(Y1、Y2、Y6和Y7)生长状态整体显著优于未遮光培养的试管苗(Y3、Y4、Y5和Y8)，遮光处理的均值差为1.082，此时的Sig.=0.000(表4)，说明用遮阳网进行遮光处理有利于小金钗春石斛试管苗的生长。用1%多菌灵对小金钗春石斛试管苗消毒10 min，均值差为-1.361，Sig.=0.000，不利于移栽。移栽时选用较大的试管苗，均值差为1.516，Sig.=0.000，说明移栽时使用较大的试管苗有利于移栽。综上可见，小金钗春石斛试管苗移栽适宜条件为Y2处理，即移栽时选择较大的苗，用遮阳网遮光处理且不用过高浓度的多菌灵对试管苗消毒过长时间。

表3 小金钗春石斛试管苗移栽试验各因素综合评分Table 3 Comprehensive scores for all factors investigated in the transplanting of D.nobile test-tube seedlings

表4 各水平间配对比较1)Table 4 Paired comparison of various levels

3 讨论

3.1 6-BA对小金钗春石斛原球茎增殖的促进作用

原球茎是一种无性胚，比丛生苗增殖快，有利于工厂化生产。通过调整植物生长调节剂的配比能够有效提高原球茎增殖系数。周辉明等[17]、陈燕[18]研究认为，不加激素的基本培养基为春石斛原球茎增殖的最适宜培养基，而侯大强等[19]认为适宜浓度的细胞分裂素对于长期离体培养原球茎的增殖是必不可少的。本研究结果与侯大强等[19]研究结论相一致。可能在长期离体培养过程中，原球茎内部已积累了较高含量的6-BA，而外源6-BA的添加使其体内细胞分裂素合成过量，进而抑制原球茎分化促进增殖。

A～H分别表示Y1、Y6、Y2、Y7、Y3、Y5、Y8、Y4处理下小金钗春石斛移栽后试管苗的生长状态。图2 移栽后的小金钗春石斛试管苗生长状态Figure 2 Growth of D.nobile test-tube seedlings after transplanting

3.2 6-BA、IBA和椰汁对小金钗春石斛原球茎增殖的共同影响

根据植物激素之间相互作用的原理，不同种类植物生长调节剂配比能够显著影响细胞分化与增殖。本研究表明，1.5 mg·L-16-BA与 0.75 mg·L-1IBA能够有效促进原球茎增殖，并达到最佳效果，且6-BA、IBA和椰汁三因素在95%的置信度下存在交互作用，说明适宜浓度配比的植物生长调节剂比单一生长调节剂更有利于小金钗春石斛原球茎增殖。该结果与霍山石斛类原球茎增殖的最佳培养条件相类似[20]。椰汁作为重要的有机添加物，富含钙、钠、钾、磷、镁、蛋白质和硫胺素等，为原球茎增殖提供营养能量来源。本试验表明，添加100 mL·L-1椰汁是小金钗春石斛原球茎增殖的最佳浓度，过高会抑制其增殖生长。该结果与李汝婷等[21]对蝴蝶兰原球茎增殖的影响因素探讨结果相一致。此外，近年来，春石斛组培研究主要集中在优良品种早期筛选、快繁及超低温保存方面[22]，优化原球茎增殖的组培快繁体系有利于春石斛优良品种选育。

3.3 环境条件对小金钗春石斛试管苗移栽的影响

本研究表明，选用较大的试管苗，移栽时适当遮光处理，但不用多菌灵消毒能够提高小金钗春石斛试管苗移栽存活率。其原因主要包含以下三点。首先，较大的植株在移栽时对逆境具有较强的抗性，这直接影响试管苗对外界环境的适应能力，是提高小金钗春石斛试管苗移栽存活率的关键。其次，用1%多菌灵对小金钗春石斛试管苗消毒10 min不利于其移栽，这与刘洪科等[23]、吴长亶[24]和叶香娟等[25]报道的情况均不相符。可能由于多菌灵浓度过高、消毒时间过长或根系在炼苗后冲洗培养基时受损，这些均可能影响春石斛试管苗移栽存活率。第三，移栽后适当遮光能够提高春石斛试管苗存活率，可能是因为试管苗的气孔和叶绿体等结构发育不正常，导致无法适应高强度的蒸腾。因此，建议在移栽初期采用适当遮光处理，避免苗弱导致的过度蒸腾进而影响存活率。建议借鉴贵州观赏春石斛的驯化移栽技术[26]，对小金钗春石斛试管苗出瓶后进行假植、缓苗、驯化及定植，有助于提高存活率，促进工厂化生产。