复方中药缓解产蛋鸡热应激研究

于文会，金银珠，姜晓文，刘 斯，孙梦晴，邹任杰，任燕龙，葛 铭，王海彬

（1.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030；2.黑龙江省普通高校动物普通疾病防治重点实验室，哈尔滨 150030；3.东北农业大学中兽医研究所，哈尔滨 150030）

热应激是机体在高温环境下因温度过高产生的非特异性应答反应[1]。热应激时，动物机体生理状态和生产性能产生明显变化，造成养殖业经济损失严重。鸡皮肤无汗腺且被覆较厚羽毛，散热性差，在夏季高温天气时，易产生热应激反应，影响养鸡业经济效益。成年蛋鸡生产最佳环境温度为19～22℃[2]，此时蛋鸡生长性能和免疫功能最佳。23～28.2℃通过加快呼吸频率散热，温度高于28℃时蛋鸡易发生热应激反应[3]。Dantzer等研究证明，热应激引发炎症性细胞因子（Ⅰnterlukin-1等）过度表达而影响鸡免疫反应[4]。当环境温度高于30℃时，产蛋鸡卵黄成熟率降低导致产蛋率下降，其发生机制可能是由于下丘脑分泌的促性腺激素水平降低，血液中孕酮、睾酮、雌激素含量均降低，影响卵巢功能和卵泡发育[5]。已有试验证明通过改变气候使卵泡大小、雌二醇浓度及促黄体生成素（Luteinizing hormone，LH）受体表达时间发生改变，延长排卵过程[6]。热应激增加蛋鸡体内活性氧（Reactive oxygen species，ROS），通过诱导细胞膜脂质过氧化降低蛋黄质量[7]。当环境温度在21～25℃时，蛋鸡产蛋率降低0.5%，25℃以上时，产蛋率下降更快[8]。不仅蛋鸡产蛋量下降，蛋品质也降低。热应激也造成鸡采食量减少，Kala等试验证明，在炎热和潮湿天气中，蛋鸡采食量减少20%[9]。Sohail等研究表明，42日龄肉仔鸡在慢性热应激下采食量降低16.4%，体重降低32.6%，料耗比提高25.6%[10]。环境温度升高至耐受温度时，鸡肠道内菌群结构发生变化，例如盲肠细菌种类和含量降低，菌群平衡[11]。热应激还导致空肠致病菌生长速度增加，致病菌对肠道产生不良刺激[12]，导致肠道内菌群失衡，增加细菌易位和炎症反应的风险[13]，主要体现在小肠绒毛区域发生水肿，绒毛断裂，绒毛高度降低，致肠绒毛表面积减少[14]。因此，热应激还可引起肠道菌群失调，影响日粮中营养物质消化吸收。

中药防控畜禽热应激是利用中兽医健脾利湿，解暑散热理论，改善脾胃功能，促进日粮消化吸收。热应激导致经济动物生产性能下降。黄芪作为补气药，广泛用于畜禽养殖。Zeng等研究表明，黄芪多糖防控奶牛热应激试验中，能够下调皮质酮，上调三碘甲状腺和甲状腺素，降低应激反应[15]。周鸿缘等研究发现，黄芪提取物可以降低热应激环境下肉鸡空肠中ⅠL-1、ⅠL-6和TNF-α的mRNA表达，增加含锰超氧化物歧化酶（MnSOD）和CAT活性[16]。王天元发现，黄芪多糖还可增加肠道绒毛高度，降低不同肠段隐窝深度，提高绒窝比[17]。刺五加是抗氧化良药，可以缓解热应激引起的氧化应激损伤。Yokozawa等研究发现，刺五加提取物可降低NO和脂质过氧化水平，增加过氧化氢酶和GSH-Px的活性[18]。在奶牛热应激试验中，刺五加缓解热应激导致的奶牛采食量下降，提高乳脂肪、乳蛋白、乳密度等关键性能指标[19]。祁延泽研究发现，饲料中添加刺五加、黄芪、延胡索组成的复方中药，对慢性热应激肉鸡的肝脏具有保护作用，可减轻肉鸡肝脏细胞空泡化和细胞肿胀，降低肉鸡血清中MDA含量，提高SOD含量[20]。

本研究以中兽医理气宽肠，利湿健脾理论为组方原则，通过测定蛋鸡产蛋率、采食量、粉料比、肠道排空及HSP70、抗氧化应激、抗炎等指标，评价复方中药缓解热应激效果，为今后中药在畜禽养殖热应激中应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验药品

中药（刺五加、黄芪、枳壳、山药、茯苓）购自哈尔滨中药材市场；SOD试剂盒、GSH-Px试剂盒、MDA试剂盒，以上试剂盒均购自南京建成科技有限公司；HSP70 ELⅠSA试剂盒、TNF-αELⅠSA试剂盒、ⅠL-6 ELⅠSA试剂盒，以上试剂盒均购自江苏酶免实业有限公司。

1.2 试验动物分组与饲养管理

85周龄海兰褐壳蛋鸡45只，体重为（1 780±50）g，购自哈尔滨市香坊区幸福养鸡场。在动物房适应性饲养7 d后，随机分为3组，每组15只，分别为正常对照组、热应激对照组和复方中药组。复方中药组和热应激对照组饲养条件为温度30～37℃，湿度55%～60%；正常对照组饲养条件为25～28℃，湿度40%。复方中药按1‰添加在日粮中，热应激对照组和正常对照组给予正常日粮；自由采食饮水，试验周期为21 d。动物使用符合东北农业大学实验动物福利与伦理委员会章程的管理和规定。

1.3 蛋鸡采食测定

每日8:00～9:00称量体重和剩余料重，记录给料量，计算日均采食量和日增重，日均采食量=（给料量-剩余料量）/每组只数。

在7、14和21 d前1 d 22:00禁食，第2天8:00饲喂记录给料量，停止采食后断食断水并记录剩余料量，报纸接取收集粪便并记录各组每次排粪时间点，报纸提前烘干称重，排空后粪便和报纸一起烘干称重，排空标准为当前排粪时间点后1 h不再排便，计算粪料比与排空时间。粪料比=排粪量/采食量，排空时间=各排粪时间点距给料时间点时间平均数。每日记录各组产蛋数。

1.4 抗氧化能力测定

采集血液后，置于37℃温箱2 h后，取出置于离心机，以3 000 r·min-1离心5 min，分离血清，保存于-80℃冰箱中。利用生化试剂盒测定血清中SOD活性、MDA含量和GSH-Px活性，测定步骤均按照说明书操作。

1.5 血清IL-6、TNF-α和HSP70测定

通过ELⅠSA试剂盒测定鸡血清，ELⅠSA试剂盒在2～8℃条件下保存，取出后在室温下平衡30 min后使用。每个样品3个复孔，每板作1次标准曲线。ⅠL-6、TNF-α、HSP70标准品浓度依次为：0、2.5、5、10、20、40 ng·L-1；0、4、8、16、32、64 ng·L-1；0、25、50、100、200、400 ng·L-1。按说明书操作后在酶标仪中读取OD值，绘制标准曲线，并通过标准曲线计算各孔浓度，保存数据并分析。

1.6 肠道菌群16S r DNA检测

在试验21 d时取鸡盲肠内容物，分装后于-80℃冰箱中保存，用于16S rDNA扩增子测序。

1.7 数据处理与分析

利用SPSS24.0（San Diego，CA，USA）对数据作统计学分析，并表示为“平均值±标准误平均值（SEM）”。组间统计学差异通过单向或双向ANOVA确定，并作邓肯检验。P＜0.05表示差异显着。利用GraphPad 7.0绘图。

2 结果与分析

2.1 日均采食量

在试验1～7 d，与热应激对照组相比，正常对照组和复方中药组日均采食量均极显著升高（P＜0.01）。在试验8～14 d，与正常对照组相比，热应激对照组日均采食量极显著降低（P＜0.01），复方中药组显著降低（P＜0.05）；与热应激对照组相比，正常对照组和复方中药组日均采食量极显著升高（P＜0.01）。在试验15～21 d，与正常对照组相比，热应激对照组日均采食量极显著降低（P＜0.01）；与热应激对照组相比，正常对照组和复方中药组日均采食量极显著升高（P＜0.01）。

结果可见，复方中药对热应激下蛋鸡日均采食量均有提升作用，可改善热应激对蛋鸡食欲降低的影响，结果见图1。

图1 复方中药对蛋鸡日均采食量的影响Fig.1 Effects of compound Chinese medicine on average daily feed intake of laying hens

2.2 粪料比

在21 d试验期中，与正常对照组相比，热应激对照组粪料比极显著升高（P＜0.01）；与热应激对照组相比，复方中药组粪料比极显著降低（P＜0.01）。结果可见，复方中药对热应激下蛋鸡粪料比有降低作用，证明其可提高日粮消化吸收率，且与正常对照组较为接近，结果见图2。

图2 复方中药对蛋鸡粪料比的影响Fig.2 Effects of compound Chinese medicine on the ratio of manure to feed

2.3 消化道排空时间

在21 d试验期中，与正常对照组相比，热应激对照组排空时间极显著升高（P＜0.01）；与热应激对照组相比，正常对照组、复方中药组排空时间极显著降低（P＜0.01）。结果可见，复方中药有减少热应激下蛋鸡排空时间的作用，结果见图3。

图3 复方中药对蛋鸡排空时间的影响Fig.3 Effects of compound Chinese medicine on the emptying time of laying hens

2.4 脾指数测定

在21 d试验期中，与正常对照组相比，热应激对照组脾指数极显著降低（P＜0.01），而复方中药组脾指数降低不显著（P＞0.05）。与热应激对照组相比，复方中药组脾指数显著升高（P＜0.05）。结果可见，复方中药对热应激引起的水湿困脾具有改善作用，结果见图4。

图4 复方中药对蛋鸡脾脏指数的影响Fig.4 Effects of compound Chinese medicine on the spleen index of laying hens

2.5 产蛋率

在试验1～7 d，与热应激对照组相比，正常对照组和复方中药组产蛋率均极显著升高（P＜0.01）。在试验8～14 d，与正常对照组相比，热应激对照组产蛋率极显著降低（P＜0.01），复方中药组显著降低（P＜0.05）；与热应激对照组相比，正常对照组产蛋率极显著升高（P＜0.01），复方中药组显著升高（P＜0.05）。在试验15～21 d，与正常对照组相比，热应激对照组产蛋率极显著降低（P＜0.01）；与热应激对照组相比，正常对照组产蛋率极显著升高（P＜0.01），复方中药组显著升高（P＜0.05）。结果表明，复方中药可缓解因热应激引起的蛋鸡产蛋率下降作用，结果见图5。

图5 复方中药对蛋鸡产蛋率的影响Fig.5 Effects of compound Chinese medicine on egg production rate of laying hens

2.6 主要氧化反应指标

在21 d试验期中，与正常对照组相比，热应激对照组GSH-Px活力极显著降低（P＜0.01），复方中药组GSH-Px活力极显著升高（P＜0.01）；与热应激对照组相比，正常对照组和复方中药组GSH-Px活力极显著升高（P＜0.01，见图6a）。

与正常对照组相比，热应激对照组、复方中药组T-SOD活力差异不显著（P＞0.05）；与热应激对照组相比，复方中药组T-SOD活力极显著升高（P＜0.01，见图6b）。

与正常对照组相比，热应激对照组MDA含量极显著升高（P＜0.01），复方中药组MDA含量显著降低（P＜0.05）；与热应激对照组相比，正常对照组、复方中药组MDA含量极显著降低（P＜0.01，见图6c）。

图6 复方中药对蛋鸡血清中GSH-Px活力、T-SOD活力、MDA含量的影响Fig.6 Effect of compound Chinese medicine on GSH-Px activity,T-SOD activity and MDA content in serum of laying hens

结果可见，复方中药对热应激下蛋鸡提升抗氧化能力作用明显，复方中药组抗氧化能力超过正常对照组。

2.7 血液中IL-6、TNF-α含量

在21 d试验期中，与正常对照组相比，热应激对照组ⅠL-6含量极显著升高（P＜0.01）；与热应激对照组相比，正常对照组、复方中药组含量极显著降低（P＜0.01）。与正常对照组相比，热应激对照组TNF-α含量极显著升高（P＜0.01）；与热应激对照组相比，正常对照组和复方中药组TNF-α含量极显著降低（P＜0.01）。结果表明，复方中药对热应激下蛋鸡炎症因子增加均有缓解作用，结果见图7。

图7 复方中药对蛋鸡血清中IL-6、TNF-α含量的影响Fig.7 Effects of compound Chinese medicine on the contents of IL-6 and TNF-αin the serum of laying hen

2.8 血液中HSP70含量

在21 d试验期中，与热应激对照组相比，正常对照组和复方中药组HSP70含量极显著降低（P＜0.01，见图8）。结果表明，在复方中药作用下蛋鸡热应激反应明显降低。

图8 复方中药对蛋鸡血清中HSP70含量的影响Fig.8 Effects of compound Chinese medicine on the content of HSP70 in the serum of laying hens

2.9 肠道菌群16S r DNA测定

2.9.1 肠道菌群Alpha多样性分析

测序深度较小时，OTU数目变化斜率较大，当深度达40 000 reads时OTU数目变化斜率较小，曲线趋于平缓，表明试验中40 000 reads测序深度量可开展微生物多样性分析（见图9）。

图9 Alpha多样性分析结果Fig.9 Results of Alpha diversity analysis

2.9.2 肠道菌群组成

根据物种注释结果，选取每组样品在各级分类学门水平（Phylum）相对丰度生成的柱状图。在门水平上，拟杆菌门（Bacteroides）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）为3个占比优势菌门。复方中药组与正常对照组相对丰度差异较小（见图10）。

图10 肠道菌群门水平相对丰度测定结果Fig.10 Results of gut microbiota phylum level relative abundance determination

3 讨 论

热应激时机体产生大量ROS，包括超氧阴离子（O2-·）、羟自由基（OH·）和过氧化氢（H2O2）。ROS在体内逐渐蓄积，当机体抗氧化能力不足以清除大量ROS，内环境平衡破坏，过多ROS导致DNA损伤、脂质过氧化、蛋白质羰基化等，影响机体正常生理功能[21]。机体内产生大量ROS引起线粒体氧化磷酸化反应速率加快，线粒体电子转移效率降低并导致电子泄露，产生大量超氧根离子（O2-·）[22]。O2-·生成速率加快，降低SOD-1的mRNA水平[23]。破坏机体抗氧化系统平衡，最终导致机体发生损伤。当发生热应激时，鸡生产性能如日增重、产蛋率及料重比均受影响[24]。因此，缓解热应激对鸡生长过程中产生的负面作用，可降低养殖户经济损失。有关缓解热应激降低畜禽生产性能下降研究较多，有物理降温、中药、调节机体电解质平衡等多种方法，其中中药通过调节五脏功能缓解热应激广受关注[25]。单安山等研究在饲料中添加0.5%～1%中草药饲料添加剂，可缓解热应激[26]。本研究依据中兽医暑湿邪气理论，暑湿困脾，可致脾运化水谷功能减弱，采食量下降，导致畜禽生产性能下降。本研究以理气宽肠，利湿健脾为组方原则，理气宽肠选用枳壳；利湿健脾，选用茯苓、山药。结果显示试验1～7 d、8～14 d、15～21 d，复方中药组采食量、粪料比、肠道排空、产蛋率等指标均高于热应激对照组，表明复方中药通过健脾胃，促进消化，缓解热应激引起生产性能下降。

当发生热应激时，家禽机体处于高温环境下，造成抗氧化功能的一系列酶活性下降，活性氧积蓄增加，机体氧化-抗氧化失衡，引起机体氧化损伤。热应激时血液中GSH-Px活性和SOD活性降低，而MDA含量显著增加。本研究发现，热应激对照组GSH-Px活性和SOD含量低于正常对照组，而热应激对照组MDA含量显著高于正常对照组。

热休克反应是一种保护细胞、组织和机体免受环境应激因素有害影响的一种稳态机制。在发生热应激时，HSP70表达上调抵抗应激反应[27]，常用来作为热应激重要分子标记蛋白。丛霞等研究表明中药活性成分灯盏乙素通过调控HSP70缓解热应激[28]。本研究中，发生热应激时，热应激对照组血清中HSP70含量显著高于正常对照组，在饲料中添加复方中药后，血清中HSP70含量明显降低，在复方中药作用下，恢复至正常对照组水平。结果表明，复方中药可明显缓解热应激，降低血清中HSP70表达。当发生热应激时，机体为维持稳态，免疫系统紧急激活，出现炎症反应，其中TNF-α、ⅠL-6是机体内重要炎症因子。本研究结果表明，与正常对照组相比，热应激对照组TNF-α、ⅠL-6含量极显著升高，说明热应激引起鸡血管内皮细胞释放ⅠL-6和TNF-α，发生炎症反应；与热应激对照组相比，复方中药组ⅠL-6、TNF-α含量极显著降低（P＜0.01），表明复方中药通过抗炎作用缓解热应激。

肠道菌群在受高温等异常环境刺激后，组分发生改变，导致肠道健康受损，营养吸收减少，肠壁完整性遭到破坏并引发免疫系统功能障碍。肠道菌群检测结果表明，根据物种注释结果，分析每组样品在门水平的差异可知，拟杆菌门（Bacteroides）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）为肠道优势菌门，与前人研究结果一致[29-30]。结果显示热应激增加拟杆菌门相对丰度，减少厚壁菌门、变形菌门相对丰度，复方中药组一定程度上可缓解这种变化。但有关复方中药通过调控肠道菌群缓解产蛋鸡热应激相关机制有待进一步研究。

4 结论

复方中药干预产蛋鸡热应激，通过加快产蛋鸡胃肠排空时间，缓解由热应激导致的蛋鸡采食量下降；通过抗炎、抗应激作用，缓解热应激导致的产蛋鸡生殖系统损伤；通过提高拟杆菌、厚壁菌等优势菌群占比，改善因热应激导致的肠道益生菌群丰度失衡。