冬虫夏草菌固体发酵人参的工艺优化

辛 宇，邱智东，陈天丽，王伟楠，曲 墨

（长春中医药大学，长春 130117）

人参被誉为“百草之王”，是传统名贵中药材之一。其主要活性成分为人参皂苷，此外还有有机酸、挥发油、氨基酸、甾醇等多种化学成分[1-4]。作为一种药用价值极高的中药材，人参在医药、保健、饮料、化妆品领域发挥着越来越重要的作用。但人参的生物利用度低并具有温燥之性，这些特点成为了人参应用过程中不可忽视的问题。为了进一步扩大人参药材的应用范围，目前对其的加工方法主要有物理[5-6]、化学[7]和生物法[8]，这些方法在保存人参药效，增效减毒，改变药物性能等方面取得了不同的成效。药用真菌双向固体发酵技术是将传统中药与现代生物技术的优势融合，以含有活性成分的中药材作为发酵基质[9]，发酵过程中药用真菌与基质相互作用，中药基质为真菌的生长提供营养，真菌生长繁殖过程中产生的酶对药材中的活性成分进行结构修饰，产生新的化学成分可提高中药中有效成分的含量，从而达到增效减毒的目的[10-14]。本研究以人参为发酵基质，利用国家卫生健康委员会公布的可用于保健食品的菌种：冬虫夏草菌作为发酵菌株，进行双向固体发酵。利用单因素实验和响应曲面等方法对人参虫草发酵基质（参草菌质）的发酵工艺进行优化，以期为人参发酵的后续研究提供参考和依据。

1 材料、试剂及仪器

1.1 主要材料 冬虫夏草菌（cordyceps sinensis）CICC14017：中国工业菌种保藏中心；人参（Panax ginsengC.A.Meyer）：吉林大药房。

1.2 试剂 葡萄糖（西陇化工股份有限公司，分析纯），酵母浸粉（北京奥博星生物技术有限公司，生化试剂），琼脂粉（天津市光复精细化工研究所，生化试剂），蛋白胨（北京奥博星生物技术有限公司，生化试剂），磷酸二氢钾（西陇化工股份有限公司，分析纯）。

1.3 主要仪器 CJ-2D 型双人净化工作台（天津市泰斯特仪器有限公司），LDZX-50KBS压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械有限公司），DNP-9102恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司），HZP-250 全温震荡培养箱（上海精宏实验设备有限公司）。

2 方法

2.1 培养基的配制 马铃薯葡萄糖琼脂（Potato dextrose agar，PDA）培养基[15]：将马铃薯去皮后称取200 g 并切成小块，加入蒸馏水1.0 L 后煮沸，用六层纱布趁热滤出滤渣。琼脂15 g/L，葡萄糖20 g 依次加入滤液中，分装试管，加塞、包扎，放入121 ℃的高温高压蒸汽灭菌锅中灭菌23 min，取出放凉后备用。

种子液为优化的MBM 培养基：取葡萄糖20 g/L、酵母浸粉8 g/L、蛋白胨12 g/L、MgSO41 g/L、KH2PO40.5 g/L、CaCO30.5 g/L、MnSO40.5 g/L、维生素B110 mg/L，蒸馏水1.0 L，在121 ℃的高温高压蒸汽灭菌锅中灭菌23 min，冷却后备用。

2.2 参草菌质的制备工艺 将斜面保存的冬虫夏草菌（cordyceps sinensis）CICC14017接种于种子液培养基，于28 ℃，180r/min 条件下发酵3 d，将种子液中的菌丝体接种于灭菌放凉后的人参固体培养基中，放入恒温培养箱，于28 ℃条件下发酵至冬虫夏草菌丝形成明显的菌蕾结构。

2.3 双向固体发酵工艺的优化

2.3.1 单因素实验 分别考察人参-冬虫夏草菌双向固体发酵中人参的粉碎粒度（10目、20目、40目、80目、160 目）、人参固体培养基初始含水量（20%、30%、40%、50%、60%）、接菌量（50%、100%、150%、200%、250%）、无机盐种类[16-20]（空白、MnCl2、CuSO4、MgCl2、CaCl2、NaCl）以确定最佳的发酵工艺。

2.3.2 Box-Behnken 实验 结合单因素实验结果，选取药材粉碎粒度、药材含水量和CaCl2浓度为因变量，以发酵周期为评价指标，设计3 因素3 水平的响应面试验。响应面试验优化因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken 试验因素水平表

3 结果与分析

3.1 单因素实验结果

3.1.1 基质粒度对发酵周期的影响 随着人参药材目粒度的增大，发酵周期呈先减少再增加的趋势。当粉碎粒度为80 目时，发酵周期最短，为41 d；当药材粉碎目粒度＜80 目时，药材与菌丝体接触不充分，而粉碎粒度＞80 目时，会减少培养基中氧气的流通，导致发酵周期变长。所以基质粉碎粒度为80 目更合适人参发酵。见图1。

图1 药材粉碎粒度对发酵周期的影响

3.1.2 基质含水量对发酵周期的影响 随着人参培养基含水量的增加，发酵周期呈先减少再增加的趋势。当含水量为40%时，发酵周期最短为39 d，表明向基质中加入适量的水有利于冬虫夏草菌的定殖和代谢，而当含水量继续增加时，由于培养基中的水分子使得空气中湿度增加，阻碍了真菌的有氧呼吸，导致发酵周期变长。所以药材中的含水量为40%比较合适人参发酵。见图2。

图2 基质含水量对发酵周期的影响

3.1.3 接种量对发酵周期的影响 随着人参基质上接种量的增加，发酵周期逐渐缩短。当接种量为200%时，继续增加接菌量，发酵周期没有明显的变化，所以选择接种量为冬虫夏草菌丝体湿重与人参固体培养基干重的比例（m:m）=200%更适合人参发酵。见图3。

图3 菌丝体接种量对发酵周期的影响

3.1.4 无机盐对发酵周期的影响 通过对比不添加无机盐的空白组，添加CuSO4、NaCl 和MgCl2会不同程度的增加参草菌质的发酵周期，而无机盐CaCl2和MnCl2的添加则会减少参草菌质的发酵周期，其中CaCl2促进发酵的效果更为明显，发酵周期为34 d，所以筛选出CaCl2作为参草菌质固体发酵的生长因子。见图4。

图4 无机盐对发酵周期的影响

3.2 优化响应面实验

3.2.1 Box-Behnken 实验设计及结果 在单因素实验基础上，以冬虫夏草菌丝可观察到菌蕾结构即为发酵终点的发酵周期（Y）为响应值，药材粉碎粒度（A）、基质含水量（B）及CaCl2浓度（C）采用响应曲面法优化发酵条件，根据Box-Behnken 实验设计[21]原理。利用Design Expert 10.0 软件对实验数据进行多元拟合，得到发酵周期（Y）的二次多元回归方程为：Y=31.4+8A+9B-10C-0.5AB-2.6AC+8BC+9.6A2-5B2-3.4C2+12.8ABC-7A2B-8.5AB2

此模型的P值=0.002 ＜0.05，极显著，失拟项P值=0.1234 ＞0.05，不显著，说明实验中未考虑的因素对结果影响不显著。决定系数R2=0.991 6，调整系数R2Adj=0.966 6，说明该模型可准确反应各因素对发酵周期的影响，模型对实际情况拟合良好。一次项B、C及二次项A2对结果影响极显著（P＜0.01），而其他项对结果不显著（P＞0.05）。三种因素对发酵周期的影响程度排序为CaCl2浓度（C）＞基质含水量（B）＞药材粉碎粒度（A）。

3.2.2 响应曲面实验结果分析 利用Design Expert 10.0 软件分析得到各因素间交互作用对人参发酵周期（Y）的影响，参草菌质的发酵周期会随着药材目粒度的增加而表现出先减少后增加的变化。并且发酵周期随着基质含水量的增加而逐渐增加，说明在35%～45%的范围内基质含水量的增加会降低发酵效率。同时发酵周期随着CaCl2的加入逐渐减少，说明在160～200 μmol/g 的范围内CaCl2的加入可以增加参草菌质的发酵效率。响应值对应因素的作用程度，CaCl2浓度影响最为显著，发酵周期随CaCl2浓度的变化而显著变化；基质含水量对发酵周期的影响较为显著，但其曲面较CaCl2浓度稍显平缓；药材粉碎粒度的曲面较于含水量稍显平缓，该结论与回归模型分析结果一致，各因素对发酵周期的影响程度排序为CaCl2浓度＞基质含水量＞药材粉碎粒度。结果见图5。

图5 药材粉碎粒度、基质含水量、CaCl2 加入量交互作用对发酵周期的响应面及等高线

对二次多元回归方程求解，得到参草菌质最优发酵工艺为：药材粉碎粒度80 目，基质含水量为28%，CaCl2的加入量为206 μmol/g，得出的最优理论发酵周期为25 d。

3.2.3 工艺验证实验 称取人参药材，按优化后的工艺进行3 次平行试验，得到的平均发酵周期为27 d。工艺验证结果与理论计算的25 d 存在些许差异，但已小于响应曲面设计实验组中最短的发酵周期，所以利用响应面法优化的参草菌质发酵工艺条件准确合理，应用价值较大。

4 结论

本实验通过单因素试验分别考察人参粉碎粒度、基质初始含水量、接菌量、无机盐种类对冬虫夏草菌发酵人参发酵周期的影响，进而采用Box-Behnken 试验设计，并利用响应曲面法对核心发酵参数进行优化，预测并验证出冬虫夏草菌固体发酵人参的最佳工艺，极大的缩短了发酵周期，证明该技术在中药固体发酵工艺优化过程中的可行性，同时也为后续发酵人参的系统研究与开发提供了稳定的原料输出，为新颖中药化学成分的挖掘奠定了良好的物质基础。